細胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準備：

1）準備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號21875-091)，90%；優(yōu)質胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲存。

二．細胞處理：

1）復蘇細胞：將含有1mL細胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

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商品介紹：

使用方法：

收到細胞后，請按照以下方法進行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時或者過夜，以穩(wěn)定細胞狀態(tài)。

2. 待細胞達到80%匯合時準備進行傳代培養(yǎng)。

3. 細胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細胞一次；

2) 添加0.125%消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當?shù)谋壤M行接種傳代，然后補充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5% CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

培養(yǎng)操作：

1）復蘇細胞：將含有 1mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或將 細胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細胞密度。

2）細胞傳代：如果細胞密度達 80%-90%，即可進行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細胞消化情況，若細胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細胞凍存：待細胞生長狀態(tài)良好時，可進行細胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細胞凍存時，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計數(shù)板計數(shù)。

2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細胞，根據細胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細胞懸液，注意凍 存管做好標識。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個小時以后轉入液氮灌儲存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

對于懸浮細胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

2 ug YEP352 YEP352 低溫運輸，-20℃保存

10g 酸洗玻璃珠(直徑：400μm)  常溫

2 ug pAcGP67A pAcGP67A 低溫運輸，-20℃保存

胰蛋白胨大豆肉湯TSB（1kg）  1kg

1瓶 BGC-823細胞株 BGC-823 低溫運輸和保存

乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 Lactobacillus Agar Medium 250g

200U 糖基化抑制劑 Uracil Glycosylase Inhibitor (UGI) -20℃保存

25mL Orange-G/Blue?嵌?L?

大鼠結腸黏膜上皮細胞NEDD4  神經前體細胞發(fā)育下調蛋白4抗體 規(guī)格: 0.2ml

CPA6  胰羧肽A6抗體 規(guī)格: 0.2ml

Nucleoprotein/NP  A型毒核蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

FRMD5  FRMD5蛋白抗體 規(guī)格: 0.2ml

SCYLV  甘蔗SCYLV抗體 規(guī)格: 1mlPhospho-Tuberin/TSC2(Ser664)  磷酸化結節(jié)性硬化蛋白抗體 規(guī)格: 0.1ml

2 ug pBI Tet pBI Tet 低溫運輸，-20℃保存

硫細菌培養(yǎng)基 Medium-sulfur bacteria 250g

150mL 丙烯葡聚糖凝膠 S-400 HR Sephacryl S-400 HR 室溫保存

1000mL Semi Dry Blot Transfer Buffer  Semi Dry Blot Transfer Buffer  常溫保存

100次 總抗氧化能力檢測試劑盒（ABTS快速法） Oxidative Stress Detection Kit 常溫保存

1瓶 RWPE-1細胞株 RWPE-1 低溫運輸和保存

50T 魚特定基因序列PCR檢測試劑盒   低溫運輸，-20℃保存