細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號(hào)21875-091)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

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商品介紹：

使用方法：

收到細(xì)胞后，請按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2) 添加0.125%消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細(xì)胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

培養(yǎng)操作：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜）。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤洗細(xì)胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細(xì)胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液，注意凍 存管做好標(biāo)識(shí)。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

對于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

250mL Neutralization Solution  Neutralization Solution  常溫保存

20次 即用型藍(lán)白T載體B型（T7-T3,有MCS） Instant Blue-White Vector T，Type B -20℃保存

2 ug pMKO.1 GFP B56α shRNA 6-3 pMKO.1 GFP B56α shRNA 6-3 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

豬胃消化粉  250g

1瓶 SMMC-7721細(xì)胞株 SMMC-7721 低溫運(yùn)輸和保存

沙門氏菌、志賀氏菌檢

大鼠表皮角化上皮細(xì)胞沙氏葡萄糖瓊脂（含氯） 英文名稱：Sabouraud-glucose Agar with Chloramphenicol 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠神經(jīng)細(xì)胞粘附分子1(NCAM1)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

酪蛋白葡萄糖肉湯 英文名稱：Sabouraud-dextrose Broth 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠神經(jīng)特異性烯醇化(NSE)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

大豆胨酵母浸粉瓊脂（PYE） 英文名稱：Phytone Yeast Extract Agar 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠神經(jīng)肽Y(NPY)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

營養(yǎng)鹽瓊脂（AATCC30） 英文名稱：Nutrient-salts Agar 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠神經(jīng)絲蛋白L(NF-L)免疫試劑盒*直銷

WLD培養(yǎng)基 英文名稱：WLD Medium 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠神經(jīng)生長因子前體(proNGF)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

不*瓊脂培養(yǎng)基 英文名稱：Incomplete Agar Medium 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠神經(jīng)生長因子(NGF)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

ISP培養(yǎng)基2 英文名稱：ISP Medium 2 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

氯溶液（20mg） 英文名稱： 產(chǎn)品規(guī)格：1ml*5 小鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白4(NRG4)免疫試劑盒*直銷

LG培養(yǎng)基 英文名稱：(Linden Grain Medium) 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白3(NRG3)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

菌種培養(yǎng)基 英文名稱：Strain Medium(for B.Cereus) 產(chǎn)品規(guī)格：250g 小鼠神經(jīng)調(diào)節(jié)蛋白2(NRG2)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝