細(xì)胞培養(yǎng)操作規(guī)程：

一．培養(yǎng)基及培養(yǎng)凍存條件準(zhǔn)備：

1）準(zhǔn)備RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640：GIBCO，貨號(hào)21875-091)，90%；優(yōu)質(zhì)胎牛血清，10%。

2）培養(yǎng)條件： 氣相：空氣，95%；二氧化碳，5%。 溫度：37℃，培養(yǎng)箱濕度為70%-80%。

3）凍存液：90%血清，10%DMSO，現(xiàn)用現(xiàn)配，液氮儲(chǔ)存。

二．細(xì)胞處理：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有1mL細(xì)胞懸液的凍存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于凍存管蓋部）搖晃解凍，移入事先準(zhǔn)備好的含有4mL培養(yǎng)基的15ml離心管中混合均勻。在1000RPM條件下離心4分鐘，棄去上清液，加入1mL培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液移入含有5ml培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過(guò)夜。第二天換液并檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá)80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

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商品介紹：

使用方法：

收到細(xì)胞后，請(qǐng)按照以下方法進(jìn)行操作。

1. 取出25cm2培養(yǎng)瓶，75%酒精消毒，拆下封口膜，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6-8小時(shí)或者過(guò)夜，以穩(wěn)定細(xì)胞狀態(tài)。

2. 待細(xì)胞達(dá)到80%匯合時(shí)準(zhǔn)備進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

3. 細(xì)胞傳代

1) 吸出25cm2培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)基，用PBS清洗細(xì)胞一次；

2) 添加0.125%消化液約1mL至培養(yǎng)瓶中，37℃溫浴3min左右；倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后吸棄消化液，再加入*培養(yǎng)液終止消化；

3) 用吸管輕輕吹打混勻，按1:2或1:3等適當(dāng)?shù)谋壤M(jìn)行接種傳代，然后補(bǔ)充新鮮的*培養(yǎng)基至5mL，放入37℃，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

4) 待細(xì)胞*貼壁后，培養(yǎng)觀察。之后每隔2-3天更換新鮮的*培養(yǎng)基。

培養(yǎng)操作：

1）復(fù)蘇細(xì)胞：將含有 1mL 細(xì)胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 入 4mL 培養(yǎng)基混合均 勻。在 1000RPM 條件下離心 4 分鐘，棄去上清液，補(bǔ) 加 1-2mL 培養(yǎng)基后吹勻。然后將所有細(xì)胞懸液加入培養(yǎng)瓶中培 養(yǎng)過(guò)夜（或?qū)?細(xì)胞懸液加入 10cm 皿中，加入約 8ml 培養(yǎng)基，培養(yǎng)過(guò)夜）。第二天換液并 檢查細(xì)胞密度。

2）細(xì)胞傳代：如果細(xì)胞密度達(dá) 80%-90%，即可進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1. 棄去培養(yǎng)上清，用不含鈣、鎂離子的 PBS 潤(rùn)洗細(xì)胞 1-2 次。

2. 加 1ml 消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培養(yǎng)瓶中，置于 37℃培 養(yǎng)箱中消化 1-2 分鐘，然后在顯微鏡下觀察細(xì)胞消化情況，若細(xì)胞大部分 變圓并脫落，迅速拿回操作臺(tái)，輕敲幾下培養(yǎng) 瓶后加少量培養(yǎng)基終止消 化。

3. 按 6-8ml/瓶補(bǔ)加培養(yǎng)基，輕輕打勻后吸出，在 1000RPM 條件下離心 4 分 鐘，棄去上清液，補(bǔ)加 1-2mL 培養(yǎng)液后吹勻。

4. 將細(xì)胞懸液按 1：2 比例分到新的含 8ml 培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

3）細(xì)胞凍存：待細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好時(shí)，可進(jìn)行細(xì)胞凍存。下面 T25 瓶為類(lèi)；

1. 細(xì)胞凍存時(shí)，棄去培養(yǎng)基后，PBS 清洗一遍后加入 1ml ，細(xì)胞變圓 脫 落后，加入 1ml 含血清的培養(yǎng)基終止消化，可使用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

2. 4 min 1000rpm 離心去掉上清。加 1ml 血清重懸細(xì)胞，根據(jù)細(xì)胞數(shù)量加 入血 清和 DMSO，輕輕混勻，DMSO 終濃度為 10%，細(xì)胞密度不低于1x106/ml，每支凍存管凍存 1ml 細(xì)胞懸液，注意凍 存管做好標(biāo)識(shí)。

3. 將凍存管置于程序降溫盒中，放入-80 度冰箱，2 個(gè)小時(shí)以后轉(zhuǎn)入液氮灌儲(chǔ)存。記錄凍存管位置以便下次拿取。

對(duì)于懸浮細(xì)胞，傳代可參考以下方法：

方法一：收集細(xì)胞，1000RPM，常溫條件下離心5分鐘，棄去上清液，補(bǔ)加1-2mL培養(yǎng)液后吹勻，將細(xì)胞懸液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培養(yǎng)基的新皿中或者瓶中。

1 管 DH5α(pir)大腸桿菌 ER2566 E.coli Strain -80℃保存

2 ug pRevTR pRevTR 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

變形桿菌成套生化鑒定管（BXWS） BXWS 13種*1套/盒*10盒

2 ug pcDNA3.1（+）/RFP pcDNA3.1（+）/RFP 低溫運(yùn)輸，-20℃保存

100次 植物種屬鑒定PCR Mix 4（質(zhì)體 matK） Plant DNA Barcoding PCR Mix -20℃保存

100g 麥芽浸膏 Malt Extract 室溫陰涼干?嵌?L?

大鼠胰島β細(xì)胞NA平板（加青）（9cm） 英文名稱(chēng)：Nutrient Agar 產(chǎn)品規(guī)格：10個(gè)/包 豬髓過(guò)氧化物(MPO)免疫試劑盒*直銷(xiāo)

CIN-1瓊脂平板（9cm） 英文名稱(chēng)：CIN-1 Agar 產(chǎn)品規(guī)格：10個(gè)/包 豬水通道蛋白4(AQP-4)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

含青TSA培養(yǎng)基平板（7cm） 英文名稱(chēng)：Tryptose Soya Agar 產(chǎn)品規(guī)格：10個(gè)/包 豬水通道蛋白1(AQP-1)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

含青接觸皿培養(yǎng)基平板（5.5cm） 英文名稱(chēng)：Contact Plate Medium 產(chǎn)品規(guī)格：10個(gè)/包 豬雙氫睪酮(DHT)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

TSA培養(yǎng)基平板（9cm） 英文名稱(chēng)：TSA 產(chǎn)品規(guī)格：10個(gè)/包 豬輸血傳播病毒/辛型肝炎病毒抗體(IgG)免疫試劑盒*直銷(xiāo)

RODAC培養(yǎng)皿（TSA）（55mm） 英文名稱(chēng)：RODAC 產(chǎn)品規(guī)格：10個(gè)/包 豬瘦素(LEP)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝

改良Skirrow氏瓊脂平板（9cm） 英文名稱(chēng)：Modified Skirrow Agar 產(chǎn)品規(guī)格：10個(gè)/包 豬食欲素受體(OXR)免疫試劑盒進(jìn)口、分裝

卵黃瓊脂平板（9cm） 英文名稱(chēng)：Mannitol-Egg-Yolk-Polymyxin Agar Base 產(chǎn)品規(guī)格：10個(gè)/包 豬食欲素/阿立新B(OX-B)免疫試劑盒現(xiàn)貨供應(yīng)

BCYE-CYS瓊脂平板（9cm） 英文名稱(chēng)：BCYE-CYS Agar 產(chǎn)品規(guī)格：10個(gè)/包 豬受體5(SSR5)免疫試劑盒*直銷(xiāo)

改良CCDA瓊脂平板（9cm） 英文名稱(chēng)：Modified CCDA Agar 產(chǎn)品規(guī)格：10個(gè)/包 豬(SS)免疫試劑盒進(jìn)口、組裝