定量PCR方法:

a、競(jìng)爭(zhēng)法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競(jìng)爭(zhēng)性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競(jìng)爭(zhēng)模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競(jìng)爭(zhēng)性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過(guò)電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開(kāi)，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長(zhǎng)度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開(kāi)來(lái)，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過(guò)氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。
PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR，后來(lái)也叫Real-Time PCR，是美國(guó)PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來(lái)的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來(lái)實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過(guò)一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過(guò)熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無(wú)法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒(méi)有線性關(guān)系，根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

?實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過(guò)對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無(wú)需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

?
實(shí)驗(yàn)過(guò)程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無(wú)到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o(wú)菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl）    1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無(wú)熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長(zhǎng)期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒(méi)有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡(jiǎn)單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒(méi)有核酸和核酸酶的污染。操作過(guò)程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過(guò)濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量?jī)?chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過(guò)程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開(kāi)，并且要充分混勻。

小鼠V-Ha-Ras肉瘤病毒癌基因同源物（HRAS）分析檢測(cè)試劑盒FABP5 (D1A7T) Rabbit mAb20 ul

兔超氧化物歧化酶Mn線粒體（SOD2）分析檢測(cè)試劑盒FABP5 (D1A7T) Rabbit mAb100 ul

人鈣激活中性蛋白酶6（CAPN6）分析檢測(cè)試劑盒Gα (pan) Antibody100 ul

人促酰化蛋白（ASP）分析檢測(cè)試劑盒MAVS Antibody20 ul

人CD44變體6（CD44-v6）分析檢測(cè)試劑盒MAVS Antibody100 ul

人5羥色（5-HT）分析檢測(cè)試劑盒MSH6 (P150) Antibody20 ul

犬白介素7受體（IL7R）分析檢測(cè)試劑盒MSH6 (P150) Antibody100 ul

犬白介素1（IL-1）分析檢測(cè)試劑盒IDH1 Antibody100 ul

犬E選擇素（SELE）分析檢測(cè)試劑盒FTH1 Antibody1 ml

貓血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子（VEGF）分析檢測(cè)試劑盒Streptavidin-HRP100 ul

馬可的松分析檢測(cè)試劑盒Troponin I Antibody100 ul

馬結(jié)合珠蛋白/觸珠蛋白（Hpt/HP）分析檢測(cè)試劑盒MCM3 (D47B6) Rabbit mAb100 ul

馬白蛋白（Albumin）分析檢測(cè)試劑盒Phospho-Troponin I (Cardiac) (Ser23/24) Antibody100 ul

雞白介素9（IL-9）分析檢測(cè)試劑盒PTEN (D4.3) XP® Rabbit mAb (Biotinylated)100 ul

雞α1酸性糖蛋白（OGCHI）分析檢測(cè)試劑盒Androgen Receptor (D6F11) XP® Rabbit mAb (Biotinylated)100 ul

大鼠和肽素（copeptin）分析檢測(cè)試劑盒Phospho-Na100 ul

大鼠雌二醇（E2）分析檢測(cè)試劑盒MCM2 Antibody100 ul
2×SYBR Green qPCR Mix試劑盒（含ROX）Penicillium│digitatum分離基物: 土壤凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 0013生長(zhǎng)條件: 25-28℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法;真空冷凍干燥法

Bacillus│megaterium分離基物: 土壤凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 598生長(zhǎng)條件: 30℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法

Aspergillus│ficuum凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 以淀粉為原料生產(chǎn)檸檬酸。培養(yǎng)基: CM0077生長(zhǎng)條件: 28-30℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法

Pseudomonas│sp.凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 2生長(zhǎng)條件: 37℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法；定期移植法

Hyphomonas│jannaschiana分離基物: 水樣/表層海水凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 潛在的有機(jī)污染物降解菌/分離自石油富集菌群培養(yǎng)基: 821生長(zhǎng)條件: 28℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法；-80℃冰箱凍結(jié)法；真空冷凍干燥法

Bacillus│thuringiensis分離基物: 1-5cm土壤斜面培養(yǎng)物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 用于抗蟲(chóng)基因的分離和抗蟲(chóng)相關(guān)基礎(chǔ)研究。培養(yǎng)基: 0002生長(zhǎng)條件: 30℃存儲(chǔ)條件: -80℃冰箱凍結(jié)法

Armillaria│bruneocystidia H.C. Wang，G.F. Qin & J. Zhao分離基物: 闊葉斜面培養(yǎng)物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 72生長(zhǎng)條件: 24存儲(chǔ)條件: 定期移植法

Escherichia│coli凍干物安全等級(jí): 2模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 致病菌芯片研發(fā)培養(yǎng)基: 51生長(zhǎng)條件: 37℃存儲(chǔ)條件: -80℃冰箱凍結(jié)法

Epicoccum│tritici Henn.分離基物: 小麥莖斜面培養(yǎng)物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 66生長(zhǎng)條件: 25存儲(chǔ)條件: 定期移植法