PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實驗方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計，熒光信號強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個循環(huán)，收集一個熒光強(qiáng)度信號，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個階段：熒光背景信號階段，熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺期。在熒光背景信號階段，擴(kuò)增的熒光信號被熒光背景信號所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實時熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

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實時熒光定量PCR：

實時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限，實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。

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定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實驗，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實現(xiàn)定量檢測目的。

人堿性成纖維細(xì)胞生長因子 Kit品牌SignalSilence® eIF4E siRNA II100µl

人巨噬細(xì)胞集落刺激因子 Kit品牌L-asparaginase/ASRGL1 Antibody100 ul

人血管性血友病因子 Kit品牌Granzyme B (D2H2F) Rabbit mAb (PE Conjugate)300 ul

人煙酰腺嘌呤二核苷酸磷酸 Kit品牌SignalSilence® mTOR siRNA II100 ul

人胰高血糖素樣肽-1 Kit說明書PDP1 (D8Y6L) Rabbit mAb100 ul

人血小板因子4 Kit圖片ALDH1A1 (D9Q8E) XP® Rabbit mAb (PE Conjugate)300 ul

人生長激素釋放肽 Kit說明書SignalSilence® p21 Waf1/Cip1 siRNA II300 ul

小鼠I型前膠原羧基端肽 Kit多少錢SignalSilence® p44/42 MAPK (Erk1/2) siRNA100 ul

小鼠β抑制蛋白-2 Kit多少錢Mcl-1 (D2W9E) Rabbit mAb (PE Conjugate)300 ul

小鼠白蛋白 Kit多少錢SignalSilence® p53 siRNA II100 ul

小鼠雌二醇 Kit說明書TMOD1 (E7E3A) XP®Rabbit mAb20 ul

小鼠內(nèi)皮型一氧化氮合酶 Kit多少錢TMOD1 (E7E3A) XP®Rabbit mAb300 ul

兔C－反應(yīng)蛋白CRP Kit說明書SignalSilence® p38 MAPK siRNA I100 ul

兔白介素8 Kit多少錢Arg3.1 (D6H9N) Rabbit mAb1 Kit

兔高密度脂蛋白HDL Kit多少錢PTMScan® Cell Growth and Death Antibody Sampler Kit300 ul

兔細(xì)胞間粘附分子1 ICAM－1 Kit品牌SignalSilence® p70/85 S6 Kinase siRNA I150 ul

柱式動物 RNAout50 次哪里有賣SignalSilence® Control siRNA (Unconjugated)100 ul
磺基羅丹明101磺酰肼Volvariella│bombycina斜面培養(yǎng)物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 食用培養(yǎng)基: 0014生長條件: 25℃存儲條件: 真空冷凍干燥法；礦物油法；定期移植法

Streptomyces│sp.分離基物: 土壤凍干物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 抗HIV培養(yǎng)基: CM0027生長條件: 28C存儲條件: 真空冷凍干燥

Vibrio│cholerae non-O1凍干物安全等級: 3模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 制備VBO血清　非O1　VBO-83培養(yǎng)基: CM0116生長條件: 37℃存儲條件: 真空冷凍干燥法

Bacillus│firmus Bredemann and Werner分離基物: 根際土斜面培養(yǎng)物安全等級: 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 141生長條件: 28存儲條件: 定期移植法

Saccharomyces│cerevisiae凍干物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 釀造酒精。培養(yǎng)基: CM0013生長條件: 28-30℃存儲條件: 真空冷凍干燥法

Bacillus│sp.分離基物: 土壤凍干物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 分類學(xué)研究培養(yǎng)基: 2生長條件: 37℃存儲條件: -80℃冰箱凍結(jié)法

Mesorhizobium│huakuii分離基物: 分離自黃棕壤中生長的紫云英根瘤凍干物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 主要用于研究質(zhì)粒之間的相互作用培養(yǎng)基: 63生長條件: 28℃存儲條件: 真空冷凍干燥法

Bacillus│licheniformis分離基物: 土壤凍干物安全等級: 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 598生長條件: 30℃存儲條件: 真空冷凍干燥法

Bacillus megaterium凍干物安全等級: 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 有機(jī)垃圾處理培養(yǎng)基: 營養(yǎng)肉汁瓊脂： 3.0g，蛋白胨 10.0g，NaCl 5.0g，瓊脂 15.0g，蒸餾水 1.0L，pH7.0。[注] 培養(yǎng)芽孢桿菌時加入5mg MnSO4·H2O，則有利于產(chǎn)生芽孢。pH7.0。121℃，15min。生長條件: 37℃，好氧存儲條件: 液氮超低溫凍結(jié)法;真空冷凍干燥法
實驗過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl）    1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。

三、注意事項

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。設(shè)立一個的PCR實驗室。

２．純化模板所選用的方法對污染的風(fēng)險有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲存，從而確保實驗與實驗之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。