定量PCR方法:

a、競爭法

選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個(gè)新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測(cè)樣品與競爭模板用同一對(duì)引物同時(shí)擴(kuò)增（其中一個(gè)引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個(gè)片段，而待測(cè)模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測(cè)定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測(cè)未知模板的起始拷貝數(shù)。

b、內(nèi)參照法

在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時(shí)，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測(cè)定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對(duì)照定量待檢測(cè)模板。

c、PCR－ELISA法

利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)目的。
PCR在分子克隆和DNA分析中有多種用途，下面就向大家介紹PCR實(shí)驗(yàn)方法步驟:

方法

1：在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。     

10×PCR buffer                   

5 μl     dNTP mix （2mM）             

4 μl     引物1（10pM）                 

2 μl     引物2（10pM）                 

2 μl     Taq酶 （2U/μl）               

1 μl     DNA模板（50ng-1μg/μl）  

1 μl      加ddH2O至 50 μl 

熒光定量PCR原理:

產(chǎn)品僅用于科研熒光定量PCR早稱TaqMan PCR，后來也叫Real-Time PCR，是美國PE（Perkin Elmer）公司1995年研制出來的一種新的核酸定量技術(shù)。該技術(shù)是在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上加入熒光標(biāo)記探針或相應(yīng)的熒光染料來實(shí)現(xiàn)其定量功能的。其原理：隨著PCR反應(yīng)的進(jìn)行，PCR反應(yīng)產(chǎn)物不斷累計(jì)，熒光信號(hào)強(qiáng)度也等比例增加。每經(jīng)過一個(gè)循環(huán)，收集一個(gè)熒光強(qiáng)度信號(hào)，這樣我們就可以通過熒光強(qiáng)度變化監(jiān)測(cè)產(chǎn)物量的變化，從而得到一條熒光擴(kuò)增曲線圖。

一般而言，熒光擴(kuò)增曲線可以分成三個(gè)階段：熒光背景信號(hào)階段，熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段和平臺(tái)期。在熒光背景信號(hào)階段，擴(kuò)增的熒光信號(hào)被熒光背景信號(hào)所掩蓋，無法判斷產(chǎn)物量的變化。而在平臺(tái)期，擴(kuò)增產(chǎn)物已不再呈指數(shù)級(jí)的增加，PCR 的終產(chǎn)物量與起始模板量之間沒有線性關(guān)系，根據(jù)終的 PCR 產(chǎn)物量也不能計(jì)算出起始 DNA 拷貝數(shù)。只有在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段， PCR產(chǎn)物量的對(duì)數(shù)值與起始模板量之間存在線性關(guān)系，我們可以選擇在這個(gè)階段進(jìn)行定量分析。為了定量和比較的方便，在實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)中引入了兩個(gè)非常重要的概念：熒光閾值和 CT值。

?

實(shí)時(shí)熒光定量PCR：

實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測(cè)的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測(cè)一次熒光信號(hào)的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對(duì)每個(gè)樣品Ct值的計(jì)算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個(gè)基礎(chǔ)之上的：

1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時(shí)，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對(duì)數(shù)期），此時(shí)微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性*，即同一模板不同時(shí)間擴(kuò)增或同一時(shí)間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。

2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)定，因此，實(shí)時(shí)熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。

外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時(shí)熒光定量PCR是迄今為止定量準(zhǔn)確，重現(xiàn)性的定量方法，已得到*的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測(cè)等諸多領(lǐng)域。

?
實(shí)驗(yàn)過程:

一、試劑準(zhǔn)備

1. DNA模板

2．對(duì)應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計(jì)的引物。可以是DNA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計(jì)。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計(jì)不同的引物）

3．10×PCR Buffer

4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步驟 

1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。

      10×PCR buffer             5μl

      dNTP mixl                 4μl

       引物1（10pM）               2μl

       引物2（10PM）              2μl

       Taq酶（2U/μl）            1μl

      DNA模板（50ng-1μg/μl）    1 μl

      加ddH2O至               50 μl

    視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。

2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。

3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測(cè)或-20℃長期保存。

4．PCR的電泳檢測(cè)：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測(cè)。

三、注意事項(xiàng)

１．PCR反應(yīng)應(yīng)該在一個(gè)沒有DNA污染的干凈環(huán)境中進(jìn)行。設(shè)立一個(gè)的PCR實(shí)驗(yàn)室。

２．純化模板所選用的方法對(duì)污染的風(fēng)險(xiǎn)有極大影響。一般而言，只要能夠得到可靠的結(jié)果，純化的方法越簡單越好。

３．所有試劑都應(yīng)該沒有核酸和核酸酶的污染。操作過程中均應(yīng)戴手套。

４．PCR試劑配制應(yīng)使用zui高質(zhì)量的新鮮雙蒸水，采用0.22μm濾膜過濾除菌或高壓滅菌。

５．試劑都應(yīng)該以大體積配制，試驗(yàn)一下是否滿意，然后分裝成僅夠一次使用的量儲(chǔ)存，從而確保實(shí)驗(yàn)與實(shí)驗(yàn)之間的連續(xù)性。

６．產(chǎn)品僅用于科研試劑或樣品準(zhǔn)備過程中都要使用一次性滅菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿應(yīng)洗滌干凈并高壓滅菌。

７．PCR的樣品應(yīng)在冰浴上化開，并且要充分混勻。

D-丙氨醇保存Phospho-Mnk1 (Thr197/Thr202) Antibody100 ul

BOC-D-絲氨酸價(jià)格CHD1 (D8C2) Rabbit mAb100 ul

CBZ-D-丙氨酸保存Acetyl-Histone H3 (Lys27) Antibody20 ul

FMOC-D-亮氨酸使用說明書Acetyl-Histone H3 (Lys27) Antibody.15 mg

溴代十二烷基*銨使用說明書Phospho-PLK1 (Thr210) Antibody (-Specific)100 ul

蛋白保護(hù)劑TY價(jià)格ACE2 Antibody100 ul

DEAE纖維素實(shí)驗(yàn)步驟HSF1 Antibody20 ul

葡聚糖凝膠G-25價(jià)格HSF1 Antibody100 ul

DNA純化瓊脂糖凝膠FF價(jià)格RagA (D8B5) Rabbit mAb20 ul

96孔單條可拆酶標(biāo)板價(jià)格RagA (D8B5) Rabbit mAb100 ul

氧氟沙星保存APOBEC3G (D9C6Z) Rabbit mAb100 ul

胰凝乳蛋白酶（牛）使用說明書Skp2 Antibody20 ul

SP6 RNA聚合酶價(jià)格Skp2 Antibody100µl

n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷保存mCherry (E5D8F) Rabbit mAb100 ul

腦浸粉（牛）使用說明書IRAK1 Antibody (Human Specific)100 ul

隱色結(jié)晶紫價(jià)格Cyclophilin B (D1V5J) Rabbit mAb1 Kit

石炭酸復(fù)紅實(shí)驗(yàn)步驟Cyclic GMP XP® Assay Kit100 ul
Cy7.5-N-羥基琥珀酰亞胺酯Rhodotorula│mucilaginosa分離基物: 土樣凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 436生長條件: 30℃存儲(chǔ)條件: -80℃冰箱凍結(jié)法；真空冷凍干燥法

Talaromyces│flavus分離基物: 核盤菌菌核凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 用作菌核病的生物防治研究培養(yǎng)基: 14生長條件: 20℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法

Candida│fukuyamaensis分離基物: 生物樣/秋茄葉斜面培養(yǎng)物安全等級(jí): 1模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 近海酵母培養(yǎng)基: 513生長條件: 28℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法；-80℃冰箱凍結(jié)法

Acinetobacter│sp.分離基物: 生物樣/比目魚腸道內(nèi)容物凍干物模式菌株: no應(yīng)用領(lǐng)域: 共生微生物/魚類腸道共生菌培養(yǎng)基: 472生長條件: 28℃存儲(chǔ)條件: 液氮超低溫凍結(jié)法；-80℃冰箱凍結(jié)法；真空冷凍干燥法

Streptomyces│ghanaensis Wallhäusser et al.分離基物: 植物根際斜面培養(yǎng)物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 12生長條件: 28-30存儲(chǔ)條件: 定期移植法

蜂房類芽孢桿菌種屬: Paenibacillus│alvei分離基物: 蜜蜂的污仔病凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: yes培養(yǎng)基: 348生長條件: 30℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法

Bacillus│fastidiosus den Dooren de Jong分離基物: 庫安托楊對(duì)照根際土斜面培養(yǎng)物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 2生長條件: 30存儲(chǔ)條件: 定期移植法

Clostridium│botulinum其他安全等級(jí): 3模式菌株: no培養(yǎng)基: CM0121生長條件: 37℃存儲(chǔ)條件: 真空冷凍干燥法

Dactylella│zhongdianensis分離基物: 土壤斜面培養(yǎng)物；凍干物安全等級(jí): 1模式菌株: no培養(yǎng)基: 18生長條件: 25℃存儲(chǔ)條件: -80℃冰箱凍結(jié)法；真空冷凍干燥法；礦物油法