內(nèi)氏放線菌探針法熒光定量PCR試劑盒說明書

1、 試劑盒簡介貨為了適應(yīng)內(nèi)氏放線菌探針法快速檢測和疫病研究的需要，本公司參照 OIE 標準中規(guī)定的引物序列，經(jīng)多次實驗及系統(tǒng)優(yōu)化，開發(fā)生產(chǎn)了本試劑盒。應(yīng)用本試劑盒進行檢測具有快速、靈敏、特異、準確、安全操作簡單、應(yīng)用廣泛和高通量檢測等特點及優(yōu)點。2、試劑盒組成:

試劑盒組成包括核酸提取試劑和核酸擴增試劑，具體組成參見表 1：

表 1：試劑盒組成（50test/盒）

組成成分

體積

樣品 DNA 提取液 1

樣品 DNA 提取液 2

5ml×1 管

500µl×1 管

核酸擴增試劑： DEPC 水

BP PCR 反應(yīng)液

Taq 酶(5U/ul) 陰性對照

BP 陽性對照

5ml×1 管

750µl×1 管

40µl×1 管

1ml×1 管

1ml×1 管

*保存條件：樣品 DNA 提取液 1、2 和試劑盒須在-20℃保存。

3、樣本采集，存放及運輸

3.1 樣本采集

所用取樣器材必須經(jīng)過高壓滅菌并烘干。取對蝦的腮絲、肝胰腺、腹肢等組織各30mg標記后置于離心管中，按照試劑盒配套的DNA抽提試劑盒操作說明提取DNA模板。

3.2 存放

研磨后的樣本應(yīng)盡快提取 DNA；待測樣本應(yīng)避免凍融。

3.3 運輸

采用或泡沫箱加冰密封進行運輸。

4、檢測步驟

4.1.1 DNA 核酸提取操作方法(在樣本處理區(qū)進行)：

取 n 個 1.5ml 滅菌 Eppendorf 管，其中 n 為待檢樣品數(shù)和一管陰性對照之和，對每個管進行編號標記。(注：試劑盒中的陽性對照直接作為 PCR 檢測的模板，無需提取核酸)

4.1.2 每管加入 100 µl DNA 提取液 1，然后分別加入待測樣本和陰性對照各 100µl，一份樣本換用一個吸頭；混勻器上震蕩混勻 5 s,于 4℃～25℃條件下，12 000 r/min 離心 10 min。

4.1.3 盡可能吸棄上清且不碰沉淀，再加入 10µl DNA 提取液 2，混勻器上震蕩混勻 5s,于 4℃～25℃ 條件下，2 000 r/min 離心 10 s。

4.1.4 100℃ 干浴或沸水浴 10 min；加入 90µl DEPC 水，12 000 r/min 離心 10 min，吸取上清， 即為提取的 DNA，冰上保存待用（提取的 DNA 需在 2 h 內(nèi)進行 PCR 擴增或放置于-70℃冰箱內(nèi)保存）。

4.1 PCR 檢測

4.1.1 擴增試劑準備（在反應(yīng)混合物配制區(qū)進行）：

從試劑盒中取出相應(yīng)的 PCR 反應(yīng)液、Taq 酶，2000×g 離心 5 秒鐘。每個樣品測試反應(yīng)體系配制見下表 2。

表 2 每個樣品測試反應(yīng)體系配制表

試劑

PCR 反應(yīng)液

Taq 酶

合計

用量

14.5 μL

0.5μL

15μL

4.1.2 加樣（樣本處理區(qū)進行）：

向每個 PCR 管孔中各分裝 15μL 的混合液，再分別加入樣本 DNA 模板 10μL，蓋緊管蓋，500

r/min 離心 30 s。

4.1.3 PCR 檢測（在檢測區(qū)進行）： 階段，95 ℃/3 min；

第二階段，94 ℃/30 sec，60 ℃/30sec；72℃/1 min；35個循環(huán)；

第三階段，72 ℃/7 min； 第四階段，4 ℃ 保存

4.3 瓊脂糖電泳

用電泳緩沖液制備 1.5%的瓊脂糖凝膠平板。將平板放入水平電泳槽，使電泳緩沖液剛好沒過膠面，向 PCR 擴增產(chǎn)物中加入 1/6 體積的電泳上樣緩沖液（6X 上樣緩沖液），按比例混勻后加入樣品孔。在電泳時設(shè)立 DNA DL2000 Marker 做對照。5 V/cm 電泳約 0.5h，當溴酚藍到達一定位置時停止。在紫外燈下或凝膠成像儀的紫外透射光下觀察是否擴增出預(yù)期的特異性 DNA 電泳帶，拍攝并記錄。

5、結(jié)果判定

5.1 PCR 后，陽性對照會出現(xiàn)一條 196bp 的 DNA 段。陰性對照和空白對照沒有該核酸帶。

5.2 待測樣品 PCR 擴增后能在相應(yīng) 196 bp DNA 位置上有帶，可判為 BP 核酸陽性。

6、相關(guān)技術(shù)信息

F: 5’-GAT-CTG-CAA-GAG-GAC-AAA-CC-3’

R: 5’-TAC-CCT-GCA-TTC-CTT-GTC-GC-3’