L-蘋果酸(L-MA)試劑盒使用說明書

本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中 L-蘋果酸(L-MA)水平。用純化的   L-蘋果酸

(L-MA)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入 L-蘋果酸(L-MA)，

再與 HRP 標(biāo)記的 L-蘋果酸(L-MA)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標(biāo)抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗

滌后加底物 TMB 顯色。TMB 在 HRP 酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終

的黃色。顏色的深淺和樣品中的植物 L-蘋果酸(L-MA)呈正相關(guān)。用酶標(biāo)儀在 450nm 波長(zhǎng)下

測(cè)定吸光度（OD 值），通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品中 L-蘋果酸(L-MA)濃度。

2.      加樣：分別設(shè)空白孔（空白對(duì)照孔不加樣品及酶標(biāo)試劑，其余各步操作相同）、標(biāo)準(zhǔn)孔、

待測(cè)樣品孔。在酶標(biāo)包被板上標(biāo)準(zhǔn)品準(zhǔn)確加樣 50µl，待測(cè)樣品孔中先加樣品稀釋液 40µl，

然后再加待測(cè)樣品 10µl（樣品終稀釋度為 5 倍）。加樣將樣品加于酶標(biāo)板孔底部，盡

量不觸及孔壁，輕輕晃動(dòng)混勻。

3.      溫育：用封板膜封板后置 37℃溫育 30 分鐘。

4.      配液：將 30 倍濃縮洗滌液用蒸餾水 30 倍稀釋后備用

5.         洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置 30 秒后棄去，如此

重復(fù) 5 次，拍干。

6.      加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 50µl，空白孔除外。

7.      溫育：操作同 3。

8.      洗滌：操作同 5。

9.         顯色：每孔先加入顯色劑 A50µl，再加入顯色劑 B50µl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色

10 分鐘.

10.    終止：每孔加終止液 50µl，終止反應(yīng)（此時(shí)藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色）。

11.    測(cè)定：以空白空調(diào)零，450nm 波長(zhǎng)依序測(cè)量各孔的吸光度（OD 值）。  測(cè)定應(yīng)在加終止

液后 15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

計(jì)算

以標(biāo)準(zhǔn)物的濃度為橫坐標(biāo)，OD 值為縱坐標(biāo)，在坐標(biāo)紙上繪出標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的

OD 值由標(biāo)準(zhǔn)曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋倍數(shù)；或用標(biāo)準(zhǔn)物的濃度與 OD 值計(jì)算出標(biāo)

準(zhǔn)曲線的直線回歸方程式，將樣品的 OD 值代入方程式，計(jì)算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，