elisa定量試劑盒原位雜交實驗操作步驟
一質粒制備

1質粒的轉化和擴增

1.1制備XL1-Blue感受態(tài)細菌

1.取400uLXL1-Blue菌種加入到含200mllb培養(yǎng)基的錐形瓶中，37℃、100rpm培養(yǎng)4h，離心，倒置，以冰冷的0.1mol/LCaCl_2重懸細菌，冰浴30min，離心，棄上清，倒置，再加4ml(含15%甘油)冰冷的CaCl2重懸細菌，分裝(200μ/tube)，-80℃保存。

2.轉化：在冰浴中將1管XL1-Blue感受態(tài)菌解凍，將濃度為2ng/μ1的質粒dna4μ1加入到8Oμ1感受態(tài)菌中。

3.輕輕搖勻，冰浴30min。

4.42℃熱激9O秒，然后迅速冰浴2min。

5.加入LB培養(yǎng)液(無氨芐青霉素)0.8ml，在37℃，100轉/min水浴孵育60min。

6.取200μl菌液鋪于瓊脂板上(涂有X-Gal(20mg/ml)-IPTG(200mg/ml)的LB-氨芐青霉素50mg/ml,1μl/ml培養(yǎng)基)，待菌液全部被吸收后，倒置平板于37℃培養(yǎng)12-16h。

1.2鑒定和挑選含重組質粒的菌落

1.用無菌牙簽挑取單菌落，接種到10ml含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)液的離心管中，于37℃，200轉/分培養(yǎng)2h，取1ml之一eppendorf離心管，加50μl10mmol/LEDTA(pH8.0)。

2.加入50μl新配置的0.2mol/LNaOH、0.5%SDS、20%蔗糖溶液后，振蕩30秒。

3.在70℃溫育5min，然后冷卻到室溫。

4.加1.5μ14mol/LKCl和0.5μ1含0.4%溴酚蘭染液，振蕩3O秒后，冰浴5min。

5.12000g，4℃離以3min，以除去細菌碎片。

6.制備1%的瓊脂糖凝膠(含EB0.5μg/ml)，取50μl上清液加入到樣品孔中，其中一孔加入中等分子量DNAMarker。恒壓50V，進行電泳。

7.當溴酚蘭遷移到凝膠全長的2/3-3/4時，停止電泳，在紫外燈下檢查質粒DNA分于量的大小是否與轉入質粒相符。

1.3質粒的擴增和純化

1.用無菌牙簽分別挑取單個白色菌落移入含30mlLB-氨芐青霉素(50μg/ml)培養(yǎng)液的聚丙烯管中，于37℃，200轉/分培養(yǎng)3h。

2.將菌液轉入含70mlLB-氨芐青霉素培養(yǎng)液的250ml錐形瓶中，37℃，200轉/分培養(yǎng)過夜(12-16h)，細菌渾濁。

3.菌液中加入氯霉素液(34mg溶于lml乙醇，100ml菌液加入0.5ml氯霉素溶液，終濃度為170μ/ml)。37℃，200轉/分培養(yǎng)12-16h。

4.將培養(yǎng)的細菌倒入50ml的離心管中，6000rpm，4℃離,th,15min，沉淀細菌。

5.棄凈上清夜，用2ml預冷的溶液I，懸浮菌體沉淀，劇烈振蕩，于室溫靜置5min

6.加入新配制的溶液II4ml，快速用手晃動10秒，顛倒數次后，于室溫靜置10min。

7.加入預冷的溶液III3ml，溫和振蕩l0秒，于冰上靜置10min，出現白色絮狀沉淀。

8.6000rpm，4℃離心15min，保留上清。

9.將上清(若帶細菌殘片，則再次離心)移入另一50ml的離心管中，加入0.6倍體積的異丙醇混勻，于室溫靜置10min。(或-20℃4h，或4℃過夜，可便核酸沉淀)

10.12000rpm，4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘兼上清液流盡。

11.于室溫用70%的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使zui后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。

12.用500μlTE(pH8.0)溶解核酸沉淀，轉移至1.5mlEppendorf管中。

13.加入用冰預冷的5mol/L的LiCl溶液600μl，充分混勻。12000rpm，4℃離心15min，以沉淀高分子量的RNA。

14.將上清轉移到另一1.5mlEppendorf管中，加等量異丙醇，充分混勻，于室溫靜置10min。

15.12000rpm,4℃離心15min，回收核酸。小心棄去上清，倒置離心管使殘余上清液流盡。

16.于室溫用70%的乙醇洗滌沉淀物和管壁，室溫12000rpm離心，15min，充分棄去乙醇，于室溫將離心管倒置在紙巾上，使zui后殘余的痕量乙醇揮發(fā)殆盡。

17.400μl含無DNA酶的RNA酶(20μg/ml)的TE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀，將溶液轉移到另-1.5mlEppendorf管中，室溫放置1.5mlEppendorf管中30min。

18.加入400μl13%(v/v)的PEG8000-NaCl(1.6mol/L)，混勻，4℃12000rpm離心5min以回收質粒DNA，棄去上清。

19.加入400μlTE緩沖液(pH8.O)溶解沉淀，再分別用等體積的Tris、酚：lvfang：(25：24：1)、和lvfang各抽提一次。

20.將水相(上清)移入另一1.5mlEppendorf管中，加入O.1體積(約50μ13M的醋酸鈉(pH5.2)和2倍體積(大約1ml)的無水乙醇，充分混勻后于4℃放置30min。

21.于4℃12000rpm離心5min回收沉淀的質粒DNA。盡可能棄去上清，敞開管口，置工作臺上使殘留的痕量乙醇蒸發(fā)殆盡。

22.加入400μl處于4℃的70%乙醇，稍加振蕩，漂洗沉淀，4℃12000rpm離心2min。

23.吸去上清，室溫敞開管口，直到乙醇*揮發(fā)。

24.用100μlTE緩沖液(pH8.0)溶解沉淀。

25.取4μl溶液1：100稀釋后，測定其OD260、OD280，以確定質粒DNA的純度和濃度(OD260/OD280>1.8。OD260/OD280對DNA而言其值大約為

1.8，高于2.0則可能有RNA污染，低于1.8則有蛋白質污染。;DNA濃度=OD260X0.05X稀釋倍數(μg/μl)。

26.質粒DNA溶液于-20℃保存待用。
elisa定量試劑盒鞘磷脂(SPH)ELISA試劑盒 ，英文名： SPH ELISA Kit

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鞘氨醇-1-磷酸磷酸酶1(SGPP1)ELISA試劑盒 ，英文名： SGPP1 ELISA Kit

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橋連整合因子2(BIN2)ELISA試劑盒 ，英文名： BIN2 ELISA Kit

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橋粒芯糖蛋白4(DSG4)ELISA試劑盒 ，英文名： DSG4 ELISA Kit

橋粒芯糖蛋白3(DSG3)ELISA試劑盒 ，英文名： DSG3 ELISA Kit

橋粒芯糖蛋白1(DSG1)ELISA試劑盒 ，英文名： DSG1 ELISA Kit

橋粒芯膠粘蛋白3(DSC3)ELISA試劑盒 ，英文名： DSC3 ELISA Kit

橋粒芯膠粘蛋白2(DSC2)ELISA試劑盒 ，英文名： DSC2 ELISA Kit

橋粒芯膠粘蛋白1(DSC1)ELISA試劑盒 ，英文名： DSC1 ELISA Kit

橋粒聯結蛋白(AHNAK)ELISA試劑盒 ，英文名： AHNAK ELISA Kit

橋粒斑蛋白(DSP)ELISA試劑盒 ，英文名： DSP ELISA Kit

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羥酸氧化酶2(HAO2)ELISA試劑盒 ，英文名： HAO2 ELISA Kit

羥酸氧化酶1(HAO1)ELISA試劑盒 ，英文名： HAO1 ELISA Kit

羥甲基戊二酰輔酶A合酶(HMGCS)ELISA試劑盒 ，英文名： HMGCS ELISA Kit

羥甲基膽素合酶(HMBS)ELISA試劑盒 ，英文名： HMBS ELISA Kit

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嵌合蛋白1(CHN1)ELISA試劑盒 ，英文名： CHN1 ELISA Kit

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前折疊蛋白亞基5(PFDN5)ELISA試劑盒 ，英文名： PFDN5 ELISA Kit

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