在PCR自動熱循環(huán)中，最關(guān)鍵的因素是變性與退火的溫度。如操作范例所示，其變性、退火、延伸的條件是：94℃60s, 37℃60s, 72℃120s，共25～30個(gè)循環(huán)，擴(kuò)增片段500bp。在這里，每一步的時(shí)間應(yīng)從反應(yīng)混合液達(dá)到所要求的溫度后開始計(jì)算。在自動熱循環(huán)儀內(nèi)由混合液原溫度變至所要求溫度的時(shí)間需要30～60s，這一遲滯時(shí)間的長短取決于幾個(gè)因素，包括反應(yīng)管類型、壁厚、反應(yīng)混合液體積、熱源(水浴或加熱塊)以及兩步驟間的溫度差，在設(shè)置熱循環(huán)時(shí)應(yīng)充分給以重視和考慮，對每一儀器 均應(yīng)進(jìn)行實(shí)測。

關(guān)于熱循環(huán)時(shí)間的另一個(gè)重要考慮是兩條引物 之間的距離;距離越遠(yuǎn)，合成靶序列全長所需的時(shí)間也越長，前文給出的反應(yīng)時(shí)間是按適于合成長度500bp的靶序列擬定的。下面就各種溫度的選擇作一介紹。

1.模板變性溫度
變性溫度是決定PCR反應(yīng)中雙鏈DNA 解鏈的溫度，達(dá)不到變性溫度就不會產(chǎn)生單鏈DNA模板，PCR也就不會啟動。變性溫度低則變性不全，DNA雙鏈會很快復(fù)性，因而減少產(chǎn)量。一般取90～95℃。樣品一旦到達(dá)此溫度宜迅速冷卻到退火溫度。DNA變性只需要幾秒種，時(shí)間過久沒有必要;反之，在高溫時(shí)間應(yīng)盡量縮短，以保持Taq DNA聚合酶的活力，加入Taq DNA聚合酶后最高變性溫度不宜超過95℃。

2.引物退火溫度
退火溫度決定PCR特異性與產(chǎn)量;溫度高特異性強(qiáng)，但過高則引物不能與模板牢固結(jié)合，DNA擴(kuò)增效率下降;溫度低產(chǎn)量高，但過低可造成引物與模板錯配，非特異性產(chǎn)物增加。一般先由37℃反應(yīng)條件開始，設(shè)置一系列對照反應(yīng)，以確定某一特定反應(yīng)的最適退火溫度。也可根據(jù)引物的(G+C)%含量進(jìn)行推測，把握試驗(yàn)的起始點(diǎn)，一般試驗(yàn)中退火溫度Ta(annealing temperature)比擴(kuò)增引物的融解溫度TTm(melting temperature)低5℃，可按公式進(jìn)行計(jì)算：

Ta = Tm - 5℃= 4(G+C)+ 2(A+T) -5℃

其中A，T，G，C分別表示相應(yīng)堿基的個(gè)數(shù)。例如，20個(gè)堿基的引物，如果(G+C)%含量為50%時(shí)，則Ta的起點(diǎn)可設(shè)在55℃。在典型的引物濃度時(shí)(如0.2μmol/L),退火反應(yīng)數(shù)秒即可完成，長時(shí)間退火沒有必要。