ＴＳＺelisa試劑盒實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)操作方法與常見問題
一、標(biāo)本的選擇與準(zhǔn)備
  用于ELISA測(cè)定的科研標(biāo)本zui為常用的是血清(漿)，有時(shí)因?yàn)樘囟ǖ臋z測(cè)目的，也用到唾液、腦脊液、尿液、糞便等標(biāo)本。目前科研上使用血清標(biāo)本測(cè)定的標(biāo)志物一般有傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物、激素、特種蛋白、細(xì)胞因子和治療藥物等。對(duì)用于激素和治療藥物測(cè)定的血清標(biāo)本的收集，要注意收集時(shí)間甚或體位有可能會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生影響。如可的松在早晨4～6點(diǎn)之間，會(huì)有一峰值出現(xiàn)：生長(zhǎng)激素、促黃體激素(LH)和促卵泡激素(FSH)均以陣發(fā)性方式釋放，因此，在測(cè)定此類激素時(shí)，有必要在密切相連的時(shí)間間隔內(nèi)采取數(shù)份血樣本，以其中間值為測(cè)定值。又如當(dāng)從臥位變?yōu)檎玖⑽粫r(shí)，血清中腎素活性將出現(xiàn)明顯增高。再如治療藥物的檢測(cè)，應(yīng)根據(jù)藥代動(dòng)力學(xué)選擇服藥后的zui適時(shí)間抽血檢測(cè)。用于傳染性病原體的抗原和抗體、腫瘤標(biāo)志物和特種蛋白等的檢測(cè)的血清標(biāo)本的收集則沒有時(shí)間和體位方面的影響，只是在處理和保存方面要考慮以下幾個(gè)方面：

(1)要注意避免出現(xiàn)嚴(yán)重溶血。血紅蛋白中含有血紅素基團(tuán)，其有類似過氧化物的活性，因此，在以HRP為標(biāo)記酶的ELISA測(cè)定中，如血清標(biāo)本中血紅蛋白濃度較高，則其就很容易在溫育過程中吸附于固相，從而與后面加入的HRP底物反應(yīng)顯色。

(2)樣本的采集及血清分離中要注意盡量避免細(xì)菌污染，一則細(xì)菌的生長(zhǎng)，其所分泌的一些酶可能會(huì)對(duì)抗原抗體等蛋白產(chǎn)生分解作用;二則一些細(xì)菌的內(nèi)源性酶如大腸桿菌的β-半乳糖苷酶本身會(huì)對(duì)用相應(yīng)酶作標(biāo)記的測(cè)定方法產(chǎn)生非特異性干擾。

(3)血清標(biāo)本如是以無菌操作分離，則可以在2～8℃下保存一周，如為有菌操作，則建議冰凍保存。樣本的長(zhǎng)時(shí)間保存，應(yīng)在-70℃以下。

(4)冰凍保存的血清標(biāo)本須注意避免因停電等造成的反復(fù)凍融。標(biāo)本的反復(fù)凍融所產(chǎn)生的機(jī)械剪切力將對(duì)標(biāo)本中的蛋白等分子產(chǎn)生破壞作用，從而引起假陰性結(jié)果。此外，凍融標(biāo)本的混勻亦應(yīng)注意，不要進(jìn)行劇烈振蕩，反復(fù)顛倒混勻即可。

(5)標(biāo)本在保存中如出現(xiàn)細(xì)菌污染所致的混濁或絮狀物時(shí)，應(yīng)離心沉淀后取上清檢測(cè)。

二、試劑的準(zhǔn)備
    在科研實(shí)驗(yàn)室，對(duì)試劑準(zhǔn)備一般不太注意，通常的做法是，在實(shí)驗(yàn)時(shí)將試劑從冰箱中拿出來即用，而忽略了這種做法有可能影響后面溫育時(shí)間不夠的問題，其直接的后果是對(duì)一些弱陽性標(biāo)本的檢測(cè)出現(xiàn)假陰性。因此在ELISA測(cè)定中試劑的準(zhǔn)備zui為關(guān)鍵的是，在實(shí)驗(yàn)開始前，將試劑盒先從冰箱中拿出來，在室溫下放置30-60分鐘，再進(jìn)行測(cè)定，以使試劑盒在使用前與室溫平衡。這樣做的目的，主要是為了在后面的溫育反應(yīng)步驟中，能使反應(yīng)微孔內(nèi)的溫度能較快地達(dá)到所要求的高度，以滿足測(cè)定要求。

三、加樣
（1） 標(biāo)本為血清：將血液先自然存放1-2小時(shí)后，再用3000rmp離心15分鐘;標(biāo)本為血漿：必須使用含抗凝劑的血液標(biāo)本收集管，采血后必須立即顛倒采血管混合5-10次，放置一段時(shí)間后，3000rpm離心15分鐘;若在幾天內(nèi)檢測(cè)，可放在2-8℃冰箱中，若要貯存，則置于-20℃的低溫冰箱內(nèi)。

（2）加樣后及時(shí)放入孵箱。 

（3）加酶試劑后用吸水紙?jiān)诿笜?biāo)板表面輕拭吸干。

（4）如果采用AT或其他全自動(dòng)加樣，選擇FAME或其他后處理儀器加酶試劑。 

（5）標(biāo)本較多時(shí)，請(qǐng)分批操作。

（6）血清樣本的加入幾乎是唯yi的要使用微量加樣器加入樣本的步驟。使用微量加樣器加樣必須注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快，要避免加在孔壁上部，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附。濺出會(huì)對(duì)鄰近孔產(chǎn)生污染。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。