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RNA的提取與核酸的顏色反應操作步驟:
1. 取材
在天平上準確稱取干酵mu 3.00g,轉移至100mL錐形瓶中。
2. 濃鹽浸提
取 27mL 10%NaCl溶液,加入到含干酵mu 的錐形瓶中,攪拌均勻;置于90~100°C水浴中,浸提30~60分鐘;冷卻。
3. 離心
將錐形瓶中提取液和沉淀全部轉移至100mL離心管中,取10mL H2O洗滌錐形瓶,并入離心管中;平衡后以4000轉/分鐘離心 15分鐘;將上清液(即RNA提取液)傾入50mL燒杯中,棄去沉淀(菌體殘渣)。
4. 沉淀RNA
(1) 冷卻:將50mL燒杯置于放有冰塊的250mL燒杯中冷卻;將溫度計插入50mL燒杯中,待溶液冷至10°C以下時,取出溫度計。
(2) 調pI:緩慢滴加 6NHCl于50mL燒杯中,用玻棒一邊輕輕攪拌溶液,一邊測量pH值,調節(jié)溶液pH至2.0~2.5范圍,溶液中白色沉淀逐漸增多,到等電點時沉淀量最多;繼續(xù)在冰浴中靜止15分鐘,使沉淀充分。
(注意:①嚴格控制pH;②若攪拌過快核酸難以凝聚沉淀。)
5. 離心
將小燒杯中溶液和沉淀移至離心管中,再次平衡、離心(4000轉/分鐘,15分鐘);棄去上清液,保留RNA沉淀。
6. 洗滌與抽濾
(1) 洗滌:取10mL 95%乙醇加到含RNA沉淀的離心管中,懸浮沉淀,浸泡5分鐘。
(2) 抽濾:取大小合適的濾紙,先在數(shù)字顯示天平上稱重;然后放入布氏漏斗中,用少量乙醇濕潤濾紙,開啟真空泵,使濾紙貼緊漏斗,將沉淀及溶液全部轉移至布氏漏斗內(nèi);再用15mL 95%的乙醇洗滌離心管,淋洗濾渣。
7. 干燥
用小鑷子取出布氏漏斗中的沉淀物和濾紙,轉移至表面皿上,置于80°C烘箱內(nèi)干燥。
8. 稱重
取出樣品,在室溫下冷卻數(shù)分鐘后,將沉淀物及濾紙置于數(shù)字顯示天平上稱重。
9. 顏色反應
(1) 溶解:取50mL水溶解RNA沉淀,同時加2滴NaOH助溶。
顏色反應:取4支潔凈、干燥的試管,按下表所示順序操作
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