1、模板原因

①  模板中含有雜蛋白質(zhì)。

②  模板中含有Taq酶抑制劑。

③  模板中蛋白質(zhì)沒有消 化除凈，特別是染色體中的組蛋白。

④  在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚。

⑤  模板核酸變性不*。在酶和引物質(zhì)量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處 理，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改。

2、酶失活

①  需更換新酶，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因酶的活性喪失或不夠而 導(dǎo)致假陰性。

②  忘加Taq酶或溴乙錠。

3、引物

①  引物質(zhì)量。

②  引物的濃度。

③  兩條引物的濃度是否對稱。

解決對策：

①  選定一個好的引物合成單位。

②  引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn)，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶，一條引物無條帶，此時做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決。如一條引物亮度高，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度。

③  引物應(yīng)高濃度小量分裝保存，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。

④  引物設(shè)計不合理，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等。

4、Mg2+濃度

①  濃度過高降低PCR擴增的特異性。

②  濃度過低影響PCR擴增產(chǎn)量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。

5、反應(yīng)體積的改變

①  通常進行PCR擴增采用的體積為20 ul、30 ul、50 ul或100 ul，應(yīng)用多大體積進行PCR擴增，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定;

②  在做小體積如20 ul 后，再做大體積時，一定要模索條件，否則容易失敗。

6、物理原因

①  變性對PCR擴增來說相當重要，如變性溫度低，變性時間短，極有可能出現(xiàn)假陰性。

②  退火溫度過低，可致非特異性擴增而降低特異性擴增效率；退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴增效率。

③  擴增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度有問題。

7、靶序列變異

①  靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結(jié)合。

②  靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列。