一、6孔板

1.將處于對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞胰酶消化后，*培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清）重懸成細(xì)胞懸液，并計(jì)數(shù)；

2.細(xì)胞接種：于6孔板培養(yǎng)板中各實(shí)驗(yàn)組接種400-1,000個(gè)細(xì)胞/孔（根據(jù)細(xì)胞生長情況確定，一般為700個(gè)細(xì)胞/孔）;

3.繼續(xù)培養(yǎng)到14天或絕大多數(shù)單個(gè)克隆中細(xì)胞數(shù)大于50為止，中途每隔3天進(jìn)行換液并觀察細(xì)胞狀態(tài)；

4.克隆完成后，在顯微鏡下對(duì)細(xì)胞進(jìn)行拍照，然后PBS洗滌1次，每孔加入1 mL 4%多聚甲醛固定30-60 min，PBS洗滌1次；

5.每孔加入結(jié)晶紫染液1ml，染細(xì)胞10-20 min；

6.PBS 洗滌細(xì)胞數(shù)次，晾干，數(shù)碼相機(jī)拍照（分別對(duì)整個(gè)六孔板及每個(gè)孔進(jìn)行單獨(dú)拍照）。

注意事項(xiàng)

1.每隔3天進(jìn)行換液，在換液時(shí)，緩慢加入培養(yǎng)基，避免吹起細(xì)胞。

2.染色完成后，務(wù)必將染液清洗干凈，不要在孔中有殘留。

二、平皿

1.取對(duì)數(shù)生長期的各組細(xì)胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個(gè)細(xì)胞，并把細(xì)胞懸浮在*培養(yǎng)基（基礎(chǔ)培養(yǎng)基+10%胎牛血清）中備用。

2.將細(xì)胞懸液作梯度倍數(shù)稀釋，每組5個(gè)平行樣。每組細(xì)胞每皿分別接種100個(gè)細(xì)胞于含10ml 37℃預(yù)溫培養(yǎng)液的皿中，并輕輕轉(zhuǎn)動(dòng)，使細(xì)胞分散均勻。

3.置37℃、5% CO2及飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3周。

4.當(dāng)培養(yǎng)皿中出現(xiàn)肉眼可見的克隆時(shí)，終止培養(yǎng)。棄去上清液，用PBS小心浸洗2次。

5.加純甲醇或1:3醋酸/甲醇5ml，固定15分鐘。

6.去固定液，加適量Giemsa應(yīng)用染色液染10～30分鐘

7.用流水緩慢洗去染色液，空氣干燥。

8.將平皿倒置并疊加一張帶網(wǎng)格的透明膠片，用肉眼直接計(jì)數(shù)克隆，或在顯微鏡（低倍鏡）計(jì)數(shù)大于10個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)。最后計(jì)算克隆形成率。

克隆形成率=（克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)）×100%

注意事項(xiàng)

平板克隆形成實(shí)驗(yàn)方法簡單，適用于貼壁生長的細(xì)胞。適宜底物為玻璃的、塑料瓶皿。

實(shí)驗(yàn)成功的關(guān)鍵是細(xì)胞懸液的制備和接種密度。細(xì)胞一定要分散得好，不能有細(xì)胞團(tuán)，接種密度不能過大。

數(shù)據(jù)分析

顯微鏡下觀察陽性克隆，即每個(gè)克隆>50個(gè)細(xì)胞，相機(jī)拍照，數(shù)克隆數(shù)（大小約在0.3-1.0 mm）計(jì)算克隆形成率，并統(tǒng)計(jì)克隆大小。