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ELISA試劑盒的結(jié)果判定分為定性和定量兩種 ,在間接法和夾心法ELSIA中,陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反,陰性孔呈色深于陽性孔。那么兩類結(jié)果如何判斷呢?
一.間接法和夾心法
這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標(biāo)本也無色或近于無色者判為陰性,顯色清晰者為陽性。但在ELSIA中,正常人血清反應(yīng)后??沙霈F(xiàn)呈色的本底,此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異,因此實驗中必須加測陰性對照。陰性對照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判斷結(jié)果時,更宜用顯色深于陰性對照作為標(biāo)本陽性的指標(biāo)。
目視法簡捷明了,但頗具主觀性。在條件許可下,應(yīng)該用比色計測定吸光值,這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本(sample,S)、陽性對照(P)、和陰性對照(N)的吸光值,然后進行計算。計算方法有多種,大致可分為陽性判定值法和標(biāo)本與陰性對照比值法兩類。
1.陽性判定值
陽性判定值(cut-off value)一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù),以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。
用此法判斷結(jié)果要求實驗條件十分恒定,試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化,陽性和陰性的對照品應(yīng)符合一定的規(guī)格,須配用精密的儀器,并嚴(yán)格按規(guī)定操作。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標(biāo)本的實驗檢測而得到的?,F(xiàn)舉某種檢測HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿,陽性對照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng/ml。每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后,先計算陰性對照A值的平均數(shù)(NCX)和陽性對照A值的平均數(shù)(PCX),兩個平均數(shù)的差(P-N)必須大于一個特定的數(shù)值(例0.400),試驗才有效。3個陰性對照A值均應(yīng)≥0.5×NCX,并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范圍,則棄去,而已另兩個陰性對照重新計算NCX;如有兩個陰性對照A值超出以上范圍,則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算:陽性判定值=NCX+0.05,標(biāo)本A值>陽性判定值的為陽性,小于陽性判定值的為陰性。應(yīng)注意的是,式中0.05為該試劑盒的常數(shù),只適合于該特定條件下,而不是對各種試劑均可通用。
根據(jù)以上敘述可以看出,在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質(zhì)控作用,試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會產(chǎn)生"試驗無效"的后果。
標(biāo)本/陰性對照比值
ELISA試劑盒在實驗條件(包括試劑)較難保證恒定的情況下,ELISA試劑盒這種判斷法較為合適。在得出標(biāo)本(S)和陰性對照(N)的A值后,計算S/N值。也有寫作P/N的,ELISA試劑盒這里的P不代表陽性(positive),而是病人(patient)的縮寫,不應(yīng)誤解。為避免混淆,更宜用S/N表示。在早期的間接法ELISA中,有些作者定出S/N為陽性標(biāo)準(zhǔn),現(xiàn)多為各種測定所沿用。實際上每一測定系統(tǒng)應(yīng)該用實驗求出各自的S/N的閾值。更應(yīng)注意的是,N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清。有的試劑盒中所設(shè)陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液,以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此,這類試劑盒規(guī),如N<0.05(或其他數(shù)值),則按0.05計算,否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果。
二.競爭法
在競爭法ELISA中,陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競爭抑制物的量,一般調(diào)節(jié)陰性對照的吸光度在1.0-1.5之間,此時反應(yīng)zui為敏感。
競爭法ELISA不易用自視判斷結(jié)果,因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對照的顯色差異,一般均用比色計測定,讀出S、P和N的吸光值。計算方法主要也有兩種,即陽性判定值法和抑制率法。
1.陽性判定值法
與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同,但在計算公式中引入陽性對照A值,現(xiàn)舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復(fù)鈣人血漿,陽性對照中抗HBc含量為125±100u/ml。每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后,先計算陰性對照A值的平均值(NCX)和陽性對照A值的平均數(shù)(PCX),兩個平均數(shù)的差(N-P)必須大于一個特定的數(shù)值(例如0.300),試驗才有效。3個陰性對照A值均應(yīng)小于2.000,而且應(yīng)≥0.5×NCX并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范圍,則棄去,而以另2個陰性對照重新計算×NCX;如有2個陰性對照A超出以上范圍,則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算:陰性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX,標(biāo)本A值≤陽性判定值的反應(yīng)為陽性,A>陽性判定值的反應(yīng)為陰性。
2.抑制率法
ELISA試劑盒抑制率表示標(biāo)本在競爭結(jié)合中標(biāo)本對陰性反應(yīng)顯色的抑制程度,按下式計算:
抑制率(%)= (陰性對照A值-標(biāo)本A值)×/陰性對照A值,一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性,<50%為陰性。
無水磷酸三鈉 英文名(EN): Sodium phosphate tribasic,96% No.: 7601-54-9 規(guī)格(SP): 100G 類別(Key): 通用試劑
無水硫代硫酸鈉 英文名(EN): Sodium thiosulfate,≥98.0% No.: 7772-98-7 規(guī)格(SP): 250G 類別(Key): 通用試劑
甲醛合次硫酸氫鈉 英文名(EN): Hydroxymethanesulfinic acid monosodium... No.: 6035-47-8 規(guī)格(SP): 100G 類別(Key): 通用試劑
2-甲酰苯磺酸鈉 英文名(EN): 2-Formylbenzenesulfonic acid sodium sa... No.: 1008-72-6 規(guī)格(SP): 25G 類別(Key): 通用試劑
無水四硼酸鈉 英文名(EN): Sodium tetraborate,99% No.: 1330-43-4 規(guī)格(SP): 50G 類別(Key): 通用試劑
紅鋁溶液 英文名(EN): SBAH,≥60 wt. % No.: 22722-98-1 規(guī)格(SP): 50G 類別(Key): 通用試劑
雙(*基硅烷基)氨... 英文名(EN): Sodium bis(trimethylsilyl)amide,98% No.: 1070-89-9 規(guī)格(SP): 1G 類別(Key): 通用試劑
雙(2-乙己基)磺基丁... 英文名(EN): Aerosol OT,98% No.: 577-11-7 規(guī)格(SP): 25G 類別(Key): 通用試劑
硫氫化鈉水合 英文名(EN): Sodium hydrosulfide hydrate,≥90% No.: 207683-19-0 規(guī)格(SP): 100G 類別(Key): 通用試劑
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核黃素磷酸鈉 英文名(EN): Riboflavin Sodium phosphate (HPLC, ≥7... No.: 130-40-5 規(guī)格(SP): 25MG 類別(Key): 通用試劑
無水鉻酸鈉 英文名(EN): Sodium chromate, anhydrous,98% No.: 7775/11/3 規(guī)格(SP): 100G 類別(Key): 通用試劑
三偏磷酸鈉 英文名(EN): Trisodium trimetaphosphate,≥95% No.: 7785-84-4 規(guī)格(SP): 500G 類別(Key): 通用試劑
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