ELISA試劑盒時(shí)刻一般不需要嚴(yán)格控制，有時(shí)可根據(jù)陽性對(duì)照孔和陰性對(duì)照孔恰當(dāng)縮短或延伸反響時(shí)刻，及時(shí)判別。此刻酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)品。反響的溫度和時(shí)刻仍是影響顯色的要素。在必定時(shí)刻內(nèi)，陰性孔可堅(jiān)持無色，而陽性孔則隨時(shí)刻的延伸而呈色加強(qiáng)。恰當(dāng)進(jìn)步溫度有助于加速顯色進(jìn)行。在定量測定中，加入底物后的反響溫度和時(shí)刻應(yīng)按規(guī)則力求。
TMB受光照的影響不大，ELISA試劑盒可在室溫中置于操作臺(tái)上，邊反響調(diào)查成果。OPD底物顯色一般在室外溫或37 ℃反響20-30分鐘后即不再加深，再延伸反響時(shí)刻，可使本底值增高。OPD底物液受光照會(huì)自行變色，顯色反響應(yīng)避光進(jìn)行，顯色反響結(jié)束時(shí)加入停止液停止反響。OPD產(chǎn)品用硫酸停止后，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。但為保證實(shí)驗(yàn)成果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)則的恰當(dāng)時(shí)刻閱覽成果。TMB經(jīng)HRP作用后，約40分鐘顯色達(dá)高峰，隨即逐步削弱，至2小時(shí)后即可*消退至無色。TMB的停止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反響停止。這類停止劑尚能使藍(lán)色維持較長時(shí)刻（12-24小時(shí)）不褪，是目視判別的杰出停止劑。
此外，ELISA試劑盒各類酸性停止液則會(huì)使藍(lán)色轉(zhuǎn)變成黃色，此刻可用特定的波長（450 nm）測讀吸光值。比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，ELISA試劑盒然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。以軟板為載體的實(shí)驗(yàn)，需先將板置于規(guī)范96孔的座架中，才可進(jìn)行比色。在加底物液顯色前，先將軟板邊際剪凈，這樣，此板就可*平妥坐入座架中。