質(zhì)譜分析蛋白的原理與方法淺述
摘要：隨著質(zhì)譜技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，利用質(zhì)譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)分析愈來(lái)愈廣泛和深入。本文簡(jiǎn)要闡述蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的原理和方法。
關(guān)鍵字： 蛋白質(zhì) 質(zhì)譜分析 原理與方法
1概述
質(zhì)譜技術(shù)具有較好的靈敏度、準(zhǔn)確度，能準(zhǔn)確測(cè)定蛋白質(zhì)。目前質(zhì)譜主要測(cè)定蛋自質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置，在對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)分析的研究中占據(jù)了重要的地位。[1,2]質(zhì)譜有進(jìn)樣器、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測(cè)器、控制電腦及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)等組成。傳統(tǒng)的質(zhì)譜僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，但隨著新的離子化技術(shù)的出現(xiàn)，如基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）等，各種質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)分析提供了一種新的且準(zhǔn)確快速的途徑。目前，酶解、液相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜及計(jì)算機(jī)算法的聯(lián)合應(yīng)用已成為鑒定蛋白質(zhì)的發(fā)展趨勢(shì)。
2質(zhì)譜分析蛋白的原理：
質(zhì)譜法分析蛋白的基本原理是通過(guò)電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場(chǎng)、磁場(chǎng)將具有特定質(zhì)量與電荷比值（M/Z）的蛋白質(zhì)離子分離開(kāi)來(lái)，經(jīng)過(guò)離子檢測(cè)器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白。通常結(jié)合相應(yīng)的處理及其他技術(shù)，能夠比較準(zhǔn)確、快速地鑒定蛋白質(zhì)。
2.1基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）
簡(jiǎn)而言之，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時(shí)間質(zhì)譜是將多肽成分轉(zhuǎn)換成離子信號(hào)，并依據(jù)質(zhì)量/ 電荷之比（M/Z）來(lái)對(duì)該多肽進(jìn)行分析，以判斷該多肽源自哪一個(gè)蛋白。基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術(shù)（MALDI）的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當(dāng)用激光照射晶體時(shí)，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導(dǎo)致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進(jìn)入氣相。MALDI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對(duì)應(yīng)關(guān)系。MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時(shí)間（TOF）檢測(cè)器來(lái)檢測(cè)，理論上講，只要飛行管的長(zhǎng)度足夠，TOF檢測(cè)器可檢測(cè)分子的質(zhì)量數(shù)是沒(méi)有上限的，因此MALDI-TOF質(zhì)譜很適合對(duì)蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子的研究。[4,7]
2.2電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）
電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）是在毛細(xì)管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場(chǎng)使從毛細(xì)管流出的液體霧化成細(xì)小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強(qiáng)度逐漸增大，zui后液滴崩解為大量帶一個(gè)或多個(gè)電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進(jìn)入氣相。電噴霧離子化的特點(diǎn)是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測(cè)的范圍，因而大大擴(kuò)展了分子量的分析范圍，離子的真實(shí)分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。
電噴霧質(zhì)譜的優(yōu)勢(shì)就是它可以方便地與多種分離技術(shù)聯(lián)合使用，如液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）是將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合而達(dá)到檢測(cè)大分子物質(zhì)的目的。
2.3 快原子轟擊質(zhì)譜技術(shù)
快原子轟擊質(zhì)譜技術(shù)（FABMS）是一種軟電離技術(shù)，是用快速惰性原子射擊存在于底物中的樣品，使樣品離子濺出進(jìn)入分析器，這種軟電離技術(shù)適于極性強(qiáng)、熱不穩(wěn)定的化合物的分析，特加適用于多肽和蛋白質(zhì)等的分析研究。
FABMS只能提供有關(guān)離子的質(zhì)量，從而可以確定樣品的元素組成和分子式。而FABMSMS串聯(lián)技術(shù)的應(yīng)用可以提供樣品較為詳細(xì)的分子結(jié)構(gòu)信息。
3質(zhì)譜分析蛋白的方法：
用于質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)的方法主要有三種：肽質(zhì)量指紋圖譜法（PMF）、串聯(lián)質(zhì)譜法（CID）和梯形肽片段測(cè)序法（ladderpeptide sequencing）。
3.1肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）
肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）即用特異性的酶解或化學(xué)水解的方法將蛋白質(zhì)切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測(cè)各產(chǎn)物肽的相對(duì)分子質(zhì)量，將所得的蛋白酶解肽段質(zhì)量數(shù)在相應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索，尋找相似肽指紋譜，從而繪制“肽圖"。由此可見(jiàn)，分子質(zhì)量的度是PMF的關(guān)鍵指標(biāo)所在，但蛋白質(zhì)的翻譯后修飾可能使PMF的質(zhì)量數(shù)與理論值不符，故這就需要與序列信息適當(dāng)結(jié)合。
3.2串聯(lián)質(zhì)譜法（CID）
串聯(lián)質(zhì)譜法（CID）是利用待測(cè)分子在電離及飛行過(guò)程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)定離子，通過(guò)分析相鄰?fù)M類型峰的質(zhì)量差，識(shí)別相應(yīng)的氨基酸殘基。串聯(lián)質(zhì)譜的肽序列圖需要讀出部分氨基酸序列與前后的離子質(zhì)量和肽段母質(zhì)量相結(jié)合，這種鑒定方法稱為肽序列標(biāo)簽（PST）。
3.3梯形肽片段測(cè)序法（ladder peptide sequencing）
梯形肽片段測(cè)序法（ladder peptide sequencing），與Edman法有相似之處，是用化學(xué)探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，產(chǎn)生包含僅異于1個(gè)氨基酸殘基質(zhì)量的系列肽，名為ladder，經(jīng)質(zhì)譜檢測(cè)，由相鄰肽峰的質(zhì)量差而得知相應(yīng)氨基酸殘基。其中的問(wèn)題是由于酶解速度不一，易受干擾。
4.蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析中的問(wèn)題
4.1蛋白質(zhì)消化
蛋白消化蛋白的基團(tuán)越大，質(zhì)譜檢測(cè)的準(zhǔn)確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測(cè)之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質(zhì)譜檢測(cè)的準(zhǔn)確率。一般而言，6- 20 個(gè)氨基酸的多肽質(zhì)譜儀的檢測(cè)。現(xiàn)今zui常用的酶為*(trypsin)，它于蛋白的賴氨酸(lysine)和*(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經(jīng)*消化后，會(huì)產(chǎn)生相同的多肽。
4.2蛋白質(zhì)修飾問(wèn)題
在目前條件下，質(zhì)譜很難給出肽段的序列，經(jīng)常會(huì)丟失一些肽段，蛋白質(zhì)磷酸化修飾也會(huì)抑制*的酶解，并且磷酸化肽的含量較非磷酸化肽段的含量少很多，質(zhì)譜對(duì)磷酸化肽的響應(yīng)就可能會(huì)被抑制。因此，要盡可能把非磷酸化肽段的含量降到zui小。減少非磷酸化肽的方法有分餾、IMAC（固相化金屬親和色譜）和抗體結(jié)合。
通過(guò)MALDI-TOF-MS測(cè)定肽段的分子量，根據(jù)所得肽段分子量比預(yù)計(jì)的分子量大80Da或其整倍數(shù)，判定是否存在磷酸化修飾。
4.3度問(wèn)題
在質(zhì)譜序列測(cè)定中，質(zhì)譜的準(zhǔn)確性對(duì)測(cè)定結(jié)果有很大影響，這是由于質(zhì)譜測(cè)序的關(guān)鍵在于測(cè)定相鄰肽鏈之間的分子量差別以判斷相應(yīng)的氨基酸殘基。如果測(cè)量的質(zhì)量誤差在0.5以上，則不能夠有效區(qū)分質(zhì)量數(shù)差在1以內(nèi)的氨基酸殘基。
參考文獻(xiàn)：
[1]王嵐等.生物質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用.生物技術(shù)通訊[J].Vol.18.2007.:166；
[2]陳晶等.質(zhì)譜在肽和蛋白質(zhì)序列分析中的應(yīng)用.有機(jī)化學(xué).2002第22卷.第二期.81-90;
[3]鄭永紅等.生物質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)鑒定中的應(yīng)用進(jìn)展.解放軍藥學(xué)學(xué)報(bào).第20卷第1期.62;
[4]劉驍勇等.蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的質(zhì)譜技術(shù).山東省醫(yī)藥生物技術(shù)研究中心；
[5]劉康等.蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的質(zhì)譜鑒定與生物信息學(xué)分析.棉花學(xué)報(bào).2008.20：281-288;
[6]成海平等.蛋白質(zhì)組研究的技術(shù)體系及進(jìn)展.生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展.2000.27(6).588;
[7]呂茂民等.生物質(zhì)譜技術(shù)及其應(yīng)用.生物技術(shù)通報(bào).2001年第4期；
[8]蔡耘等.生物質(zhì)譜技術(shù)在糖蛋白結(jié)構(gòu)分析中的應(yīng)用.2002.Sep.Vol.13.No.5.404;
[9]孟凡臣等.生物質(zhì)譜及其在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中的應(yīng)用.生物技術(shù)通報(bào).2006，May.Vol.17.468-470；
[10]韓偉東等.牛精子蛋白質(zhì)的雙向電泳和質(zhì)譜鑒定初步研究.安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào).2009，36（4）：538-542。
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