質(zhì)譜分析蛋白的原理與方法淺述
摘要：隨著質(zhì)譜技術的不斷發(fā)展與成熟，利用質(zhì)譜法進行蛋白質(zhì)分析愈來愈廣泛和深入。本文簡要闡述蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析的原理和方法。
關鍵字： 蛋白質(zhì) 質(zhì)譜分析 原理與方法
1概述
質(zhì)譜技術具有較好的靈敏度、準確度，能準確測定蛋白質(zhì)。目前質(zhì)譜主要測定蛋自質(zhì)一級結(jié)構包括分子量、肽鏈氨基酸排序及多肽或二硫鍵數(shù)目和位置，在對蛋白質(zhì)結(jié)構分析的研究中占據(jù)了重要的地位。[1,2]質(zhì)譜有進樣器、離子源、質(zhì)量分析器、離子檢測器、控制電腦及數(shù)據(jù)分析系統(tǒng)等組成。傳統(tǒng)的質(zhì)譜僅用于小分子揮發(fā)物質(zhì)的分析，但隨著新的離子化技術的出現(xiàn)，如基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）和電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）等，各種質(zhì)譜技術的出現(xiàn)為蛋白質(zhì)分析提供了一種新的且準確快速的途徑。目前，酶解、液相色譜分離、串聯(lián)質(zhì)譜及計算機算法的聯(lián)合應用已成為鑒定蛋白質(zhì)的發(fā)展趨勢。
2質(zhì)譜分析蛋白的原理：
質(zhì)譜法分析蛋白的基本原理是通過電離源將蛋白質(zhì)分子轉(zhuǎn)化為離子，然后利用質(zhì)譜分析儀的電場、磁場將具有特定質(zhì)量與電荷比值（M/Z）的蛋白質(zhì)離子分離開來，經(jīng)過離子檢測器收集分離的離子，確定離子的M/Z值，分析鑒定未知蛋白。通常結(jié)合相應的處理及其他技術，能夠比較準確、快速地鑒定蛋白質(zhì)。
2.1基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜（MALDI-TOF-MS）
簡而言之，基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜是將多肽成分轉(zhuǎn)換成離子信號，并依據(jù)質(zhì)量/ 電荷之比（M/Z）來對該多肽進行分析，以判斷該多肽源自哪一個蛋白。基質(zhì)輔助激光解吸附質(zhì)譜技術（MALDI）的基本原理是將分析物分散在基質(zhì)分子中并形成晶體，當用激光照射晶體時，由于基質(zhì)分子經(jīng)輻射所吸收的能量，導致能量蓄積并迅速產(chǎn)熱，從而使基質(zhì)晶體升華，致使基質(zhì)和分析物膨脹并進入氣相。MALDI所產(chǎn)生的質(zhì)譜圖多為單電荷離子，因而質(zhì)譜圖中的離子與多肽和蛋白質(zhì)的質(zhì)量有一一對應關系。MALDI產(chǎn)生的離子常用飛行時間（TOF）檢測器來檢測，理論上講，只要飛行管的長度足夠，TOF檢測器可檢測分子的質(zhì)量數(shù)是沒有上限的，因此MALDI-TOF質(zhì)譜很適合對蛋白質(zhì)、多肽等生物大分子的研究。[4,7]
2.2電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）
電噴霧電離質(zhì)譜（ESI-MS）是在毛細管的出口處施加一高電壓，所產(chǎn)生的高電場使從毛細管流出的液體霧化成細小的帶電液滴，隨著溶劑蒸發(fā)，液滴表面的電荷強度逐漸增大，zui后液滴崩解為大量帶一個或多個電荷的離子，致使分析物以單電荷或多電荷離子的形式進入氣相。電噴霧離子化的特點是產(chǎn)生高電荷離子而不是碎片離子，使質(zhì)量電荷比降低到多數(shù)質(zhì)量分析儀器都可以檢測的范圍，因而大大擴展了分子量的分析范圍，離子的真實分子質(zhì)量也可以根據(jù)質(zhì)荷比及電荷數(shù)算出。
電噴霧質(zhì)譜的優(yōu)勢就是它可以方便地與多種分離技術聯(lián)合使用，如液-質(zhì)聯(lián)用（LC-MS）是將液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)合而達到檢測大分子物質(zhì)的目的。
2.3 快原子轟擊質(zhì)譜技術
快原子轟擊質(zhì)譜技術（FABMS）是一種軟電離技術，是用快速惰性原子射擊存在于底物中的樣品，使樣品離子濺出進入分析器，這種軟電離技術適于極性強、熱不穩(wěn)定的化合物的分析，特加適用于多肽和蛋白質(zhì)等的分析研究。
FABMS只能提供有關離子的質(zhì)量，從而可以確定樣品的元素組成和分子式。而FABMSMS串聯(lián)技術的應用可以提供樣品較為詳細的分子結(jié)構信息。
3質(zhì)譜分析蛋白的方法：
用于質(zhì)譜分析蛋白質(zhì)的方法主要有三種：肽質(zhì)量指紋圖譜法（PMF）、串聯(lián)質(zhì)譜法（CID）和梯形肽片段測序法（ladderpeptide sequencing）。
3.1肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）
肽質(zhì)量指紋圖譜（PMF）即用特異性的酶解或化學水解的方法將蛋白質(zhì)切成小的片段，然后用質(zhì)譜檢測各產(chǎn)物肽的相對分子質(zhì)量，將所得的蛋白酶解肽段質(zhì)量數(shù)在相應的數(shù)據(jù)庫中檢索，尋找相似肽指紋譜，從而繪制“肽圖"。由此可見，分子質(zhì)量的度是PMF的關鍵指標所在，但蛋白質(zhì)的翻譯后修飾可能使PMF的質(zhì)量數(shù)與理論值不符，故這就需要與序列信息適當結(jié)合。
3.2串聯(lián)質(zhì)譜法（CID）
串聯(lián)質(zhì)譜法（CID）是利用待測分子在電離及飛行過程中產(chǎn)生的亞穩(wěn)定離子，通過分析相鄰同組類型峰的質(zhì)量差，識別相應的氨基酸殘基。串聯(lián)質(zhì)譜的肽序列圖需要讀出部分氨基酸序列與前后的離子質(zhì)量和肽段母質(zhì)量相結(jié)合，這種鑒定方法稱為肽序列標簽（PST）。
3.3梯形肽片段測序法（ladder peptide sequencing）
梯形肽片段測序法（ladder peptide sequencing），與Edman法有相似之處，是用化學探針或酶解使蛋白或肽從N端或C端逐一降解下氨基酸殘基，產(chǎn)生包含僅異于1個氨基酸殘基質(zhì)量的系列肽，名為ladder，經(jīng)質(zhì)譜檢測，由相鄰肽峰的質(zhì)量差而得知相應氨基酸殘基。其中的問題是由于酶解速度不一，易受干擾。
4.蛋白質(zhì)質(zhì)譜分析中的問題
4.1蛋白質(zhì)消化
蛋白消化蛋白的基團越大，質(zhì)譜檢測的準確率越低。因此，在質(zhì)譜檢測之前，須將蛋白消化成小分子的多肽，以提高質(zhì)譜檢測的準確率。一般而言，6- 20 個氨基酸的多肽質(zhì)譜儀的檢測?，F(xiàn)今zui常用的酶為*(trypsin)，它于蛋白的賴氨酸(lysine)和*(arginine)處將其切斷。因此，同一蛋白經(jīng)*消化后，會產(chǎn)生相同的多肽。
4.2蛋白質(zhì)修飾問題
在目前條件下，質(zhì)譜很難給出肽段的序列，經(jīng)常會丟失一些肽段，蛋白質(zhì)磷酸化修飾也會抑制*的酶解，并且磷酸化肽的含量較非磷酸化肽段的含量少很多，質(zhì)譜對磷酸化肽的響應就可能會被抑制。因此，要盡可能把非磷酸化肽段的含量降到zui小。減少非磷酸化肽的方法有分餾、IMAC（固相化金屬親和色譜）和抗體結(jié)合。
通過MALDI-TOF-MS測定肽段的分子量，根據(jù)所得肽段分子量比預計的分子量大80Da或其整倍數(shù)，判定是否存在磷酸化修飾。
4.3度問題
在質(zhì)譜序列測定中，質(zhì)譜的準確性對測定結(jié)果有很大影響，這是由于質(zhì)譜測序的關鍵在于測定相鄰肽鏈之間的分子量差別以判斷相應的氨基酸殘基。如果測量的質(zhì)量誤差在0.5以上，則不能夠有效區(qū)分質(zhì)量數(shù)差在1以內(nèi)的氨基酸殘基。
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