分光光度計(jì)已經(jīng)成為現(xiàn)代分子生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)儀器。常用于核酸、蛋白定量以及細(xì)菌生長(zhǎng)濃度的定量。我們實(shí)驗(yàn)室主要是用來測(cè)物質(zhì)的光度以求得物質(zhì)的濃度或者酶活。
基本原理
分子的紫外可見吸收光譜是由于分子 中的某些基團(tuán)吸收了紫外可見輻射光后，發(fā)生了電子能級(jí)躍遷而產(chǎn)生的吸收光譜。它是帶狀光譜，反映了分子中某些基團(tuán)的信息，可以用標(biāo)準(zhǔn)光譜圖再結(jié)合其它手段進(jìn)行定性分析。
朗伯-比爾定律：當(dāng)一束平行單色光通過含有吸光物質(zhì)的稀溶液時(shí)，溶液的吸光度與吸光物質(zhì)濃度、液層厚度乘積成正比，即
A= kcl
式中比例常數(shù)k與吸光物質(zhì)的本性，入射光波長(zhǎng)及溫度等因素有關(guān)。c為吸光物質(zhì)濃度，l為透光液層厚度。
組成
各種型號(hào)的紫外－可見分光光度計(jì)，就其基本結(jié)構(gòu)來說，都是由五個(gè)基本部分組成，即光源、單色器、吸收池、檢測(cè)器及信號(hào)指示系統(tǒng)。
1.光源
在紫外可見分光光度計(jì)中，常用的光源有兩類：熱輻射光源和氣體放電光源。
熱輻射光源用于可見光區(qū)，如鎢燈和鹵鎢燈；氣體放電光源用于紫外光區(qū)，如氫燈和氘燈。
2．單色器
單色器的主要組成：入射狹縫、出射狹縫、色散元件和準(zhǔn)直鏡等部分。
單色器質(zhì)量的優(yōu)劣，主要決定于色散元件的質(zhì)量。色散元件常用棱鏡和光柵。
3.吸收池
吸收池又稱比色皿或比色杯，按材料可分為玻璃吸收池和石英吸收池，前者不能用于紫外區(qū)。吸收池的種類很多，其光徑可在0.1~10cm之間，其中以1cm光徑吸收池zui為常用。
4、檢測(cè)器
檢測(cè)器的作用是檢測(cè)光信號(hào)，并將光信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)殡娦盘?hào)。現(xiàn)今使用的分光光度計(jì)大多采用光電管或光電倍增管作為檢測(cè)器。
5、信號(hào)顯示系統(tǒng)
常用的信號(hào)顯示裝置有直讀檢流計(jì)，電位調(diào)節(jié)指零裝置，以及自動(dòng)記錄和數(shù)字顯示裝置等。
操作步驟
操作之前
1.1 開啟電源進(jìn)行初始化
開啟主機(jī)電源，分光光度計(jì)將按屏幕所顯示的項(xiàng)目進(jìn)行自檢和初始化，如下圖所示。所有項(xiàng)目檢測(cè)完畢，初始化結(jié)束，整個(gè)過程大約需要4min（若使用多池檢測(cè)需5min）。每個(gè)項(xiàng)目進(jìn)行初始化操作時(shí)將被加亮顯示，當(dāng)初始化完成后，該項(xiàng)右邊的星標(biāo)也將加亮顯示。但是，如果檢測(cè)到任何異常，初始化過程將立即中止，星標(biāo)也不會(huì)加亮顯示。
1.2 屏幕顯示和觸摸鍵盤
UV-1700的觸摸鍵盤圖可用數(shù)字鍵0~9和功能鍵F1~F4選擇不同屏幕中的模式和設(shè)置。選擇時(shí)，按下相應(yīng)的數(shù)字鍵或功能鍵即可，無需按ENTER鍵確認(rèn)。此外，輸入數(shù)值時(shí)，如波長(zhǎng)設(shè)置或顯示模式等，必須按ENTER鍵確認(rèn)輸入值。
下面介紹每個(gè)鍵的基本功能，在不同屏幕下有一些鍵可能被賦予特殊的功能。
① START/STOP鍵
一旦參數(shù)設(shè)置完成，可用該鍵開始和停止測(cè)量過程。
② AUTO ZERO鍵
按該鍵，當(dāng)前波長(zhǎng)的吸光度自動(dòng)調(diào)整為0（T）。測(cè)量前，必須確保在樣品側(cè)和參比側(cè)中都放有盛有空白的比色池。
③ GOTOWL鍵
該鍵可用來改變當(dāng)前的波長(zhǎng)。
④ ENTER鍵
輸入數(shù)值后，按該鍵確認(rèn)。
⑤ Cursor光標(biāo)鍵（＜（-），＞）
這組鍵可控制液晶顯示屏幕中光標(biāo)的左右移動(dòng)。輸入數(shù)值時(shí)，左光標(biāo)鍵還可以用來輸入負(fù)值（-）。
⑥ Function功能鍵（F1~F4）
這組鍵的功能與液晶顯示屏幕下方所顯示的功能相對(duì)應(yīng)。
⑦ RETURN鍵
按下該鍵可返回當(dāng)前屏幕的前一屏。
⑧ MODE鍵
用該鍵可從每種測(cè)量模式的參數(shù)設(shè)置屏返回到主模式屏。
⑨ Print打印鍵
用該鍵可輸出當(dāng)前屏幕顯示的硬拷貝。
⑩ Numeric數(shù)字鍵
用該鍵可輸入數(shù)值。
? CE鍵
用該鍵可清除數(shù)值輸入錯(cuò)誤。按該鍵，已輸入的數(shù)值將被清除，可重新輸入正確的數(shù)值。
模式選擇和共享操作
初始化完成后即顯示模式選擇屏幕
各種模式概述：
在模式選擇屏幕下選擇各種測(cè)量模式，即顯示各自的參數(shù)配置屏幕。
① 光度模式
在固定波長(zhǎng)下測(cè)量樣品的吸光度或%透光率。
② 光譜模式
掃描波長(zhǎng)范圍以測(cè)量隨波長(zhǎng)變化的樣品的吸光度和%透光率。也可進(jìn)行單光束能量測(cè)量。對(duì)測(cè)得光譜可進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，如峰檢出、平滑處理和數(shù)學(xué)計(jì)算等。
③ 定量模式
用標(biāo)準(zhǔn)樣品建立校正曲線，并對(duì)未知樣品進(jìn)行定量測(cè)量。
測(cè)量方法有：1、波長(zhǎng)法；2、波長(zhǎng)法；3、波長(zhǎng)法；4、微分定量法。另外，可用下列方法建立校正曲線：K-系數(shù)法、單點(diǎn)校正曲線法、多點(diǎn)校正曲線法。
④ 動(dòng)力學(xué)模式
由吸光度隨時(shí)間的變化計(jì)算酶的活性。
若使用多池支架（可選配），zui多可測(cè)量16個(gè)樣品。以下是可供選用的測(cè)量方法：
1、波長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)測(cè)量；2、波長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)測(cè)量；3、多池動(dòng)力學(xué)測(cè)量；4、速率測(cè)量。
⑤ 時(shí)間掃描模式
該功能用于測(cè)量固定波長(zhǎng)下吸光度、透光率或能量隨時(shí)間的變化。使用多池支架（可選配）zui多可測(cè)量16個(gè)樣品，還可以對(duì)測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行數(shù)學(xué)計(jì)算等數(shù)據(jù)處理。
⑥ 多組分測(cè)量模式
可定量分析zui多8種組分的樣品。使用每種組分的純品作標(biāo)準(zhǔn)樣品，制作校正曲線，進(jìn)行定量測(cè)量。
⑦ 光度測(cè)量（多波長(zhǎng)）
zui多可8個(gè)任意波長(zhǎng)，然后分別測(cè)量每個(gè)波長(zhǎng)處的吸光度和透光率。測(cè)得吸光度后，可選擇三個(gè)計(jì)算式中的一個(gè)，對(duì)zui多為四個(gè)波長(zhǎng)下的測(cè)得數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)算，并輸出測(cè)量結(jié)果。
·2波長(zhǎng)處測(cè)得值間的比值/差值和3波長(zhǎng)測(cè)量值的計(jì)算
·用四數(shù)據(jù)計(jì)算式進(jìn)行計(jì)算：(K1A1+K2A2+K3A3+K4A4)×K5
·用四數(shù)據(jù)計(jì)算式進(jìn)行計(jì)算：K5×(K1A1+K2A2)/(K3A3+K4A4)
Kn：相關(guān)系數(shù)；An：吸光度。
⑧ 可選配程序包
使用可選配程序包時(shí)選用此模式。可選配DNA/蛋白質(zhì)程序包。
⑨ 公用模式
在該模式下可設(shè)置和改變儀器的基本操作參數(shù)。
光度測(cè)量
操作步驟如下：
1、在模式選擇屏幕中選擇＜1. Photometric光度＞選項(xiàng)，將顯示參數(shù)配置屏幕。
2、用GOTOWL鍵設(shè)定測(cè)量波長(zhǎng)。
3、按F2鍵設(shè)定進(jìn)樣控制。
3、按START/STOP鍵時(shí)，測(cè)量開始，顯示測(cè)量屏幕。
4、如需做空白校正，應(yīng)在測(cè)量前先設(shè)置空白樣品，然后按AUTOZERO鍵，將測(cè)量值置為0ABS（）。
注意事項(xiàng)
? 1、比色皿使用時(shí)注意不要沾污或?qū)⒈壬蟮耐腹饷婺p，應(yīng)手持比色皿的毛面。
? 2、待測(cè)液制備好后應(yīng)盡快測(cè)量，避免有色物質(zhì)分解，影響測(cè)量結(jié)果。
? 3、測(cè)得的吸光度A控制在0.2~0.8之間，超過1.0時(shí)要做適當(dāng)稀釋。
? 4、開關(guān)試樣室蓋時(shí)動(dòng)作要輕緩。
? 5、不要在儀器上方傾倒測(cè)試樣品，以免樣品污染儀器表面，損壞儀器。
? 6、比色皿在盛裝樣品前，應(yīng)用所盛裝樣品沖洗兩次，測(cè)量結(jié)束后比色皿應(yīng)用蒸餾水清洗干凈后倒置晾干。若比色皿內(nèi)有顏色掛壁，可用無水乙醇浸泡清洗。
? 7、向比色皿中加樣時(shí)，若樣品流到比色皿外壁時(shí)，應(yīng)以濾紙點(diǎn)干，鏡頭紙擦凈后測(cè)量，切忌用濾紙擦拭，以免比色皿出現(xiàn)劃痕。
? 8、測(cè)定紫外波長(zhǎng)時(shí)，需選用石英比色皿。
? 9、測(cè)量過程中不可打開測(cè)量室的窗門，否則會(huì)影響測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。
維護(hù)和保養(yǎng)
? 1、儀器使用一定周期后,內(nèi)部會(huì)積累一定量的塵埃,由維修工程師或在工程師指導(dǎo)下定期開啟儀器外罩對(duì)內(nèi)部進(jìn)行除塵工作,同時(shí)將各發(fā)熱元件的散熱器重新緊固,對(duì)光學(xué)盒的密封窗口進(jìn)行清潔,必要時(shí)對(duì)光路進(jìn)行校準(zhǔn),對(duì)機(jī)械部分進(jìn)行清潔和必要的潤滑,zui后,恢復(fù)原狀,再進(jìn)行一些必要的檢測(cè)、調(diào)校與記錄.
? 2、環(huán)境中的塵埃和腐蝕性氣體亦可以影響機(jī)械系統(tǒng)的靈活性、降低各種限位開關(guān)、按鍵、光電偶合器的可靠性,也是造成必須學(xué)部件鋁膜銹蝕的原因之一.因此必須定期清潔,保障環(huán)境和儀器室內(nèi)衛(wèi)生條件,防塵.
? 3、溫度和濕度是影響儀器性能的重要因素.他們可以引起機(jī)械部件的銹蝕,使金屬鏡面的光潔度下降,引起儀器機(jī)械部分的誤差或性能下降;造成光學(xué)部件如光柵、反射鏡、聚焦鏡等的鋁膜銹蝕,產(chǎn)生光能不足、雜散光、噪聲等,甚至儀器停止工作,從而影響儀器壽命.維護(hù)保養(yǎng)時(shí)應(yīng)定期加以校正.應(yīng)具備四季恒濕的儀器室,配置恒溫設(shè)備,特別是地處南方地區(qū)的實(shí)驗(yàn)室.
會(huì)員1.png)