限制性核酸內(nèi)切酶：是一類能識(shí)別雙鏈DNA分子特異性核酸序列的DNA水解酶。是體外剪切基因片段的重要工具，所以常常與核酸聚合酶、連接酶以及末端修飾酶等一起稱為工具酶。

     瓊脂糖凝膠電泳：是利用瓊脂糖溶化再凝固后能形成帶有一定孔隙的固體基質(zhì)的特性，其密度取決于瓊脂糖的濃度。在電場(chǎng)的作用下及中性pH的緩沖條件下帶負(fù)電的核酸分子就可以向陽極遷移。瓊脂糖凝的濃度影響給定大小的線狀DNA的遷移率，因此采用不同濃度的凝膠可以分離不同大小范圍的DNA*段。

     EB：即3,8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲錠溴鹽,(Ethidium Bromide)。它能夠插入DNA分子中的堿基對(duì)之間而與DNA結(jié)合。由于EB分子的插入，在紫外光的照射下，凝膠電泳中的DNA條帶呈現(xiàn)出紅色熒光，易于檢測(cè)。可以檢測(cè)10ng 的DNA。

     質(zhì)粒pCMV-Myc-T10 NEB 標(biāo)準(zhǔn)分子量片段(1kb DNA Ladder)EcoR1 和Xho1 核酸內(nèi)切酶（Takara）EcoR 1和Xho 1酶解緩沖液(10×H buffer)瓊脂糖TBE或TAE緩沖液(10×)溴化乙啶染色液(10mg/ml)上樣液(6×)：0.25% 溴酚蘭，40%(W/V)蔗糖水溶液或30%的甘油。電泳儀，電泳槽，紫外透射儀，凝膠成像儀，一次性塑料手套等.

     瓊脂糖凝膠的制備:稱取0.8g瓊脂糖，置于三角瓶中，加入100ml TBE或TAE工作液，瓶口倒扣一個(gè)小燒杯等，將該三角瓶置于微波爐加直至瓊脂溶解。

     膠板的制備:取有機(jī)玻璃內(nèi)槽，洗凈、晾干；取紙膠條(寬約1cm)，將有機(jī)玻璃內(nèi)槽置于一水平位置模具上，放好梳子。將冷卻至65℃左右的瓊脂糖凝膠液，小心地倒在有機(jī)玻璃內(nèi)槽上，控制灌膠速度和量，使膠液緩慢地展開，直到在整個(gè)有機(jī)玻璃板表面形成均勻的膠層。室溫下靜置30min左右，待凝固*后，輕輕拔出梳子，在膠板上即形成相互隔開的上樣孔。制好膠后將鋪膠的有機(jī)玻璃內(nèi)槽放在含有0.5-1×TAE（Tris-乙酸）或TBE（Tris-硼酸）工作液的電泳槽中使用。

     加樣:用微量加樣器將上述樣品分別加入膠板的樣品孔內(nèi)。每加完一個(gè)樣品，換一個(gè)加樣頭。加樣時(shí)應(yīng)防止碰壞樣品孔周圍的凝膠面以及穿透凝膠底部，本實(shí)驗(yàn)樣品孔容量約15～20μl。1 kb DNA ladder（共10條帶）: 在*個(gè)上樣孔或zui后一個(gè)上樣孔內(nèi)加入6μl 的1 kb DNA ladder（50ng/μl ）。

     電泳（帶上手套操作）:

     1.加完樣后的凝膠板即可通電進(jìn)行電泳； 

     2.建議在80～100V的電壓下電泳；

     3.當(dāng)溴酚蘭移動(dòng)到距離膠板下沿約1cm處停止電泳；

     4.將凝膠放入溴化乙啶（EB〕工作液（0.5μg/ml左右）中染色約20min。

     為了獲得電泳分離DNA*段的zui大分辨率，電場(chǎng)強(qiáng)度不應(yīng)高于5V/cm（兩電極間的距離）。電泳溫度視需要而定，對(duì)大分子的分離，以低溫較好，也可在室溫下進(jìn)行。在瓊脂糖凝膠濃度低于0.5%時(shí)，由于膠太稀，在4℃進(jìn)行電泳以增加凝膠硬度。

     觀察與拍照:在紫外燈(310nm波長)下觀察染色后的凝膠。DNA存在處顯示出紅色的熒光條帶。紫外光激發(fā)30s左右，肉眼可觀察到清晰的條帶。在紫外燈下觀察時(shí)，應(yīng)戴上防護(hù)眼鏡或有機(jī)玻璃防護(hù)面罩，避免眼睛遭受強(qiáng)紫外光損傷。拍照電泳圖譜時(shí)，可采用快速凝膠成象系統(tǒng)。

     對(duì)于未進(jìn)行酶切的質(zhì)粒來說，常會(huì)出現(xiàn)兩條電泳帶，一條是（松弛）螺旋狀質(zhì)粒DNA帶，另一條是超螺旋狀質(zhì)粒DNA的帶，以超螺旋狀質(zhì)粒DNA居多，移動(dòng)速度也zui快。有時(shí)還會(huì)出現(xiàn)三條帶，其中一條是因?yàn)橛幸恍┵|(zhì)粒DNA在提取過程中遭到損傷而線性化，其移動(dòng)速度介于螺旋狀和超螺旋狀質(zhì)粒DNA之間，所以該條電泳帶也位于上述兩種帶之間。如果提取的質(zhì)粒很好時(shí)，這條帶會(huì)很弱，有時(shí)看不到。

     本實(shí)驗(yàn)所用質(zhì)粒pCMV-Myc-T10經(jīng)EcoR1單酶切后應(yīng)為5.7kb；用EcoR1和Xho1雙酶切后應(yīng)產(chǎn)生兩條DNA*段，一條是3.8kb，另一條是1.9kb