一、準(zhǔn)備和安裝過(guò)濾器 

清洗好過(guò)濾器，放入一張孔徑0.22μm的微孔濾膜，用布包好，用15磅20min進(jìn)行高壓滅菌處理。在超凈臺(tái)內(nèi)打開(kāi)并將過(guò)濾器架好，膠管一端接入濾泵再插入待除菌的液體中，出口端膠管深入到已消毒好的瓶子中，用泵過(guò)濾后檢查濾膜是否完好。 

二、合成培養(yǎng)基的配制：

1.根據(jù)細(xì)胞目錄中的說(shuō)明，按表選擇合適品牌及貨號(hào)的培養(yǎng)基干粉，用適量超純水充分溶解。

2.按要求添加tan酸氫鈉、gu氨酸鈉等，充分?jǐn)嚢枋怪芙狻?/span>

3.pH調(diào)至7.2左右。

4.加水至zui終體積。

5.在超凈臺(tái)中對(duì)溶液進(jìn)行濾過(guò)除菌，分別裝入250mL或500mL玻璃瓶中，用翻帽塞塞緊瓶口。

6.瓶口封存好，放入4℃的冰箱進(jìn)行貯存。 

三、小牛血清的處理 

1.將血清加熱至56℃并保持30 min，其間要不時(shí)輕輕晃動(dòng)，使受熱均勻，防止沉淀析出。

2.處理后的血清貯存于4℃。

3.小牛血清在使用前進(jìn)行篩選以掌握血清的質(zhì)量。

四、生長(zhǎng)培養(yǎng)基的配制 

1.除了無(wú)血清培養(yǎng)之外，各種合成的培養(yǎng)基在使用之前都需要加入一定量的小牛血清或胎牛血清和抗菌素。 

2.培養(yǎng)基分裝成小瓶（100～200 mL）以便使用，翻帽塞塞緊瓶口。 

比例配制：基本培養(yǎng)基占80％--90％，小牛血清或胎牛血清占10％--20％。按1％的體積分?jǐn)?shù)加入雙抗貯存液（qing霉素+lian霉素），使qing霉素和llian霉素的終濃度分別為100U／mL和100μ／mL，。 

五、凍存細(xì)胞的復(fù)蘇 

1.應(yīng)遵循慢凍快融的原則。先將水浴鍋調(diào)至37-37.5°，取出凍存的細(xì)胞迅速放入后將細(xì)胞面浸至水面以下不斷搖動(dòng)至融化。 

2.在無(wú)菌臺(tái)內(nèi)將培養(yǎng)基加入到50ml的小培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，約5ml左右，然后用無(wú)菌吸管從凍存管內(nèi)取出細(xì)胞，置培養(yǎng)并內(nèi)輕輕搖晃，使細(xì)胞均勻后置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。

六、傳代 貼壁細(xì)胞:

對(duì)于貼壁細(xì)胞應(yīng)先吸/倒 進(jìn)培養(yǎng)基，吸干凈，以免中和后加入的消化液使強(qiáng)度減弱。50ml培養(yǎng)瓶加入消化液約1-3ml，晃動(dòng)使消化液鋪均勻置37°培養(yǎng)箱約2-5分鐘，鏡下見(jiàn)細(xì)胞收縮變圓或少數(shù)脫落后，輕輕振動(dòng)瓶底使細(xì)胞全部脫落，加入2-3ml培養(yǎng)基后，輕輕吹打，使細(xì)胞基本成單個(gè)懸浮，然后分置其它無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，加入培養(yǎng)基后繼續(xù)培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)。 

七、凍存 

將貼壁細(xì)胞消化后離心收集，懸浮細(xì)胞直接離心收集，以培養(yǎng)基或胎牛血清重懸細(xì)胞至終濃度約106ml。加入10%的DMSO。以每管1-2ml分裝至凍存管中。用絕熱材料包裹置-70°C的冰箱冷凍。次日保存到液氮中。 

八、注意事項(xiàng)

玻璃吸管和玻璃培養(yǎng)瓶的消毒:

1）高壓蒸汽滅菌15分鐘以上;

2）干烤消毒140度2小時(shí)以上; 

3）無(wú)菌工作臺(tái)先清洗后用75%酒精擦拭干凈，紫外線照射40分鐘以上;

4）各種培養(yǎng)板照射3小時(shí)以上; 

培養(yǎng)基（pH7.2）和血清配制好后要做無(wú)菌試驗(yàn):

1.將血清按10%加入培養(yǎng)基內(nèi)，用無(wú)菌的玻璃離心管或玻璃瓶取培養(yǎng)基5-10ml置培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)2-3天，肉眼見(jiàn)無(wú)渾濁或沉淀等異物。分裝后置4度保存; 

2.消化液（pH7.8）或其它加入液，應(yīng)用高壓蒸汽滅菌或一次性無(wú)菌濾器過(guò)濾除菌，分裝成支置-20度保存;

3.培養(yǎng)箱應(yīng)先用清水清洗后用75%酒精擦拭一遍（如有紫外線的應(yīng)照射1小時(shí)以上，如有高溫滅菌的應(yīng)按程序來(lái)菌）。至少每月一次。 

進(jìn)入操作時(shí)應(yīng)注意先清洗雙手及手腕，然后用75%酒精擦拭，操作時(shí)注意無(wú)菌臺(tái)內(nèi)空間層次。手及物品不要在暴露的瓶口上方，如果數(shù)量較多，培養(yǎng)瓶應(yīng)放在與酒精燈平行地方便于操作，瓶與瓶之間應(yīng)相隔一定的距離，開(kāi)瓶時(shí)應(yīng)先用75%酒精反復(fù)擦拭或用燈燒，打開(kāi)后先用燈先燒口，再燒蓋。用完后同樣操作。整個(gè)操作過(guò)程需靠無(wú)菌臺(tái)近點(diǎn)。