RNAi在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通常用于阻斷特定基因的表達(dá)從而研究基因的功能，常見的做法是將靶向特定基因的大約21堿基長短的雙鏈siRNAs（small interfering RNAs），或者是45—50-mer的發(fā)夾結(jié)構(gòu)RNA（small hairpin RNA, shRNA）轉(zhuǎn)染到細(xì)胞。shRNA在細(xì)胞內(nèi)會(huì)自動(dòng)被加工成為siRNA，從而引發(fā)基因沉默或者表達(dá)抑制。

        現(xiàn)在有多個(gè)報(bào)道說通過質(zhì)粒表達(dá)siRNAs同樣可以抑制特定基因的表達(dá)。盡管細(xì)節(jié)各有不同，但載體大都是用PolIII啟動(dòng)子啟動(dòng)編碼shRNA（small hairpin RNA）的序列。選用PolIII啟動(dòng)子的原因在于這個(gè)啟動(dòng)子總是在離啟動(dòng)子一個(gè)固定距離的位置開始轉(zhuǎn)錄合成RNA，遇到4—5個(gè)連續(xù)的U即終止，非常。當(dāng)這種帶有PolIII 啟動(dòng)子和shRNA編碼序列的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞時(shí)，這種能表達(dá)siRNA的質(zhì)粒確實(shí)能夠下調(diào)特定基因的表達(dá)，抑制范圍包括外源基因和內(nèi)源基因。

         采用這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于，通過siRNA表達(dá)質(zhì)粒的選擇標(biāo)記，siRNA載體能夠更長時(shí)間地抑制目的基因表達(dá)。當(dāng)然還有一點(diǎn)，那就是由于質(zhì)?？梢詮?fù)制擴(kuò)增，相比起化學(xué)合成來說，這就能夠顯著降低制備siRNA的成本。因?yàn)橘|(zhì)粒的價(jià)錢大約是3000多人民幣，還不到化學(xué)合成1條21nt的RNA價(jià)格的一半，但是就可以自行制備siRNA而不受數(shù)量的限制。

        生物通在這里為大家介紹幾種不同的siRNA合成質(zhì)粒，但是大家要注意的是這里介紹的siRNA質(zhì)粒是不同于體外轉(zhuǎn)錄合成RNA的質(zhì)粒（生物通在后文會(huì)繼續(xù)為大家介紹），因?yàn)檫@里制備的是用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的siRNA，而不是長鏈的RNA（長鏈的dsRNA不適宜用在哺乳動(dòng)物細(xì)胞，因?yàn)闀?huì)引發(fā)非特異抑制）

pSilencer siRNA 表達(dá)載體系列是用于在培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)siRNA的一系列載體。在載體上包含有RNA聚和酶III （Pol III）啟動(dòng)子，氨芐抗性基因和大腸桿菌復(fù)制子，只要將編碼一小段對(duì)應(yīng)目的基因特異序列的、其RNA能形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)（就是回文結(jié)構(gòu)）的DNA序列插入載體中Pol III 啟動(dòng)子的下游，轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞，載體就能表達(dá)出發(fā)夾結(jié)構(gòu)的RNA，這種RNA很快在細(xì)胞中加工成為siRNA。

pSilence 1.0-U6

載體pSilence 1.0-U6是采用小鼠U6 Pol III啟動(dòng)子。這個(gè)由哈佛大學(xué)開發(fā)的載體已經(jīng)成功的在Hela、H1299, U-2 OS和C-33A細(xì)胞中敲除了cdk-2和laminA/C的表達(dá)。這個(gè)載體經(jīng)過Apa I和EcoR I酶切線性化和純化，你只需要合成一對(duì)55-mer的寡核苷酸，帶有4個(gè)堿基的突出（當(dāng)然是對(duì)應(yīng)Apa I和EcoR I酶切位點(diǎn)咯），一起退火、快速連接就可以轉(zhuǎn)化了。在購買線性化的質(zhì)粒同時(shí)，廠家還提供帶有GAPDH siRNA的環(huán)形質(zhì)粒對(duì)照（萬一線性質(zhì)粒不夠用還可以自己擴(kuò)增再切嘛！）

pSilencer 2.0-U6 and pSilencer 3.0-H1
這兩個(gè)載體帶有不同的RNA Pol III 啟動(dòng)子，pSilencer 2.0-U6帶的是人的U6啟動(dòng)子，pSilencer 3.0-H1則是用H1 RNA啟動(dòng)子（RNase P的一個(gè)組成部分）。這兩個(gè)載體都是用BamH I和Hind III線性化并且經(jīng)過純化的，方便定向克隆。這兩個(gè)載體都是以線性化的質(zhì)粒供應(yīng)，同時(shí)還提供GAPDH對(duì)照和一個(gè)空白對(duì)照質(zhì)粒，以及DNA退火的Buffer。

這些表達(dá)載體已經(jīng)成功的在Hela細(xì)胞中抑制了包括Cyclophilin、GAPDH、p53、c-myc在內(nèi)的多個(gè)基因的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)表明：能夠被化學(xué)合成或者體外合成的siRNAs抑制的基因同樣可以被表達(dá)相同序列的載體生成的siRNAs抑制。