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閱讀：2發(fā)布時(shí)間：2024-12-15
RNA提取原理
RNA提取時(shí)，加氯仿后分三層：水相(含rna,可能還有少量DNA），中間白色薄層（應(yīng)該是蛋白和DNA），下層有機(jī)相（氯仿和蛋白等）
氯仿是分子量比較大的有機(jī)溶劑，在提取RNA時(shí)，氯仿可以有效的使有機(jī)相和無機(jī)相迅速分離。DNA提取過程 有機(jī)相中主要是酚和蛋白結(jié)合，從而使得蛋白和DNA脫離，DNA進(jìn)入水相。但是在RNA的提取過程就要避免蛋白和DNA脫離，否則DNA會(huì)釋放到水相。不管有酚也好，沒有酚也好，氯仿本身也對(duì)蛋白有變性作用，劇烈的震蕩，很容易使得DNA的親水基團(tuán)，與水相接觸。所以不要?jiǎng)×艺鹗帯?/p>
異丙醇的作用是通過-OH的疏水作用使得RNA 或者DNA鏈中的親水基團(tuán)受到保護(hù)，等同于沉淀，但是這是個(gè)反應(yīng)時(shí)發(fā)生在水相中有機(jī)樣品提取方法，與前面的氯仿不矛盾。
氯仿的作用有多個(gè)方面，一是作為有機(jī)溶劑變性蛋白有機(jī)樣品提取方法，使其沉淀并通過離心除去，同時(shí)也通過變性作用抑制RNase活性；二是RNA提取試劑中通常含有（Trizol主要成分就是，很多自己配試劑提的方法也用，抽提蛋白時(shí)也會(huì)用到），微溶于水，抽提烷之后水相里有痕量的酚，如果不除去會(huì)損傷核酸，需要通過氯仿把水相里參與的抽提掉；三是作為溶劑抽提樣品中的一些脂溶性雜質(zhì)（比如油脂、脂溶性色素等），起到一定除雜作用。
因?yàn)榧?xì)胞中存在DNA酶，在提取之前細(xì)胞破碎的時(shí)候沒有加DNA酶抑制劑，DNA已經(jīng)被分解了。上層水相，PH 5.1左右，當(dāng)溶液pH在酸性的時(shí)候，DNA分子就會(huì)沉淀在酚與溶液的界面，只有RNA分子留在水相。而當(dāng)pH接近中性時(shí)，DNA就會(huì)溶解在水相，（導(dǎo)致PH中性的大概原因是trizol與樣品比例不對(duì)，應(yīng)該盡量保證提取量的前提下使trizol過量）
TRIzol Reagent 提取total RNA步驟：
1. 查下表根據(jù)樣品量選擇適當(dāng)?shù)?TRIzol Reagent體積裝入50ml RNase-free離心管中，注意樣品體積不能超過TRIzol Reagent體積的10%。
組織量
TRIzol Reagent
氯仿
異丙醇
75%乙醇
50~100mg
1ml
0.2ml
1ml
1ml
2.將組織樣品放入TRIzol Reagent中，高速下勻漿15-30秒/次，直至看不見組織和細(xì)胞碎片。
3.室溫溫育10分鐘。
4. 據(jù)表2加入適量體積的氯仿，劇烈震蕩15秒鐘，然后室溫下溫育3分鐘。
5. 4oC，12000g離心15分鐘，形成淡紅色的/氯仿有機(jī)相，中間相和上層水相，水相約占TRIzol體積的60%。
6. 轉(zhuǎn)移上清于另一個(gè)Rnase-free的 50ml離心管中。根據(jù)表2加入適量異丙醇，-20oC沉淀1小時(shí)以上。
7. 4oC，12000g離心10分鐘。
8. 去上清，據(jù)表2加入適量體積的75%的乙醇混勻。
9. 4oC，7500g離心5分鐘。
10．去上清，空氣中干燥或真空抽干RNA沉淀，但不要太干。加入適量體積的DEPC-WATER，溶解沉淀。
11．取少量RNA用于測(cè)定其OD值和電泳，其余置-80oC冰箱中保存。
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