A.噬菌體的制備
1．將新鮮的或冰凍保存在細(xì)菌中的文庫(kù)儲(chǔ)液（實(shí)驗(yàn)方案9．2）轉(zhuǎn)接入200m1含有15ug/m1 的四環(huán)素的2×TY培養(yǎng)基中。我們通常轉(zhuǎn)接超過文庫(kù)容量約10倍數(shù)目的有活性的細(xì)菌細(xì)胞，以確保文庫(kù)的多樣性得以保持。可以通過把一系列的稀釋液涂布在合適的平板上培養(yǎng)的方法，測(cè)定凍存液中有活性細(xì)胞的濃度。
2．以250r/min的速度振蕩菌液，30℃培養(yǎng)16小時(shí)。
3．3700g離心過夜培養(yǎng)的菌液15分鐘，以制備噬菌體上清液。取出并保留上清液，于4℃保存。滴定上清液。

B．篩選
1．合成需要的靶標(biāo)DNA或RNA寡核苷酸，其中一組是5’端連接*的寡核苷酸鏈。為dsDNA位點(diǎn)合成一條不聯(lián)結(jié)*的互補(bǔ)副鏈。
2．①對(duì)于DNA位點(diǎn)的篩選，將每條寡核苷酸鏈各取10u1，與20/A1的2X核酸退火緩沖液混勻，讓兩條互補(bǔ)的寡核苷酸退火。在PCR儀中以94℃加熱樣品3分鐘，然后以每分鐘2℃的速度冷卻至4℃。冷卻后，用水將溶液稀釋至1pmol/L的終濃度，于-20℃保存。②對(duì)于RNA位點(diǎn)篩選，用RNA折疊緩沖液（1XCM）配制1pm01/L的寡核苷酸溶液。將溶液加熱至95℃，然后緩慢冷卻至室溫，以使RNA折疊。對(duì)于有些位點(diǎn)，“突然”冷卻至4℃可能折疊效果更好。將RNA溶液保存在4℃（雖然有些位點(diǎn)能成功地冰凍—解凍）。
3．將*聯(lián)結(jié)的靶標(biāo)位點(diǎn)（通常是1pmol）加入50,ulPBS緩沖液，加入到鏈親和素包被的小管內(nèi)。將小管于20℃放置15分鐘。 。
4．將1m1含4％（w/v）脫脂牛奶的PBS緩沖液加入小管，以封閉非特異性結(jié)合位點(diǎn)。將小管于20℃放置1小時(shí)。
5，將噬菌體上清液以1：10稀釋于1ml含有2％（w/v）脫脂牛奶、1％（體積分?jǐn)?shù)）Tween-20及20ug /ml超聲破碎鮭魚精DNA的PBS緩沖液中。為了提高篩選的特異性，加入與靶標(biāo)同源的寡核苷酸競(jìng)爭(zhēng)劑。加入與*聯(lián)結(jié)的靶標(biāo)相比過量達(dá)100倍的競(jìng)爭(zhēng)劑。
6，棄去核酸包被的小管中的封閉緩沖液，加入1ml稀釋過的噬菌體上清液。小管于20℃放置1小時(shí)。
7．將結(jié)合混合物棄去，用含2％（w/v）脫脂牛奶和l％（體積分?jǐn)?shù)）Tween—20的PBS緩沖液洗滌20次，再用PBS緩沖液?jiǎn)为?dú)洗滌一次。
8，加入100/A1 0．1m01/L的三乙醇胺并放置15秒，以洗脫保留的噬菌體。將溶液轉(zhuǎn)入一個(gè)新的小管中，并立即用等體積的1mol/LTris—HCl（pH 7．4）進(jìn)行中和。
9．將過夜培養(yǎng)的菌液以1：100接種于2×TY培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)約2小時(shí)以制備處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌TGl菌液。菌種必須源于M9小化瓊脂培養(yǎng)基平板上生長(zhǎng)的克隆，這樣才能保證F，纖毛的表達(dá)，因?yàn)檫@是噬菌體感染所必需的。
10．用50ul洗脫的噬菌體感染0．3m1處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的大腸桿菌TGl菌液，混勻后37℃靜置培養(yǎng)1小時(shí)。
11．將感染過的菌液轉(zhuǎn)入2～5ml含有15/Ig/m1的四環(huán)素的2XTY培養(yǎng)基中。 以250r/min的速度振蕩菌液，30℃培養(yǎng)16小時(shí)，為隨后幾輪的篩選制備噬菌體。
12．重復(fù)從步驟2或3到步驟12的篩選程序3～5輪。在后一輪篩選后，將感染的細(xì)菌 涂布在含15ug/m1的四環(huán)素的TYE瓊脂培養(yǎng)基平板上。這時(shí)篩選出的克隆已準(zhǔn)備好，可用于通過序列測(cè)定和ELISA進(jìn)行的進(jìn)一步的鑒定。