因?yàn)榭乖诩?xì)胞染色時(shí)需先固定，所以，抗體與抗原的結(jié)合比在溶液中結(jié)合需要更長的時(shí)間。孵育的時(shí)間可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整，但是產(chǎn)生有效結(jié)合的時(shí)間一般須超過30min。通過增加二抗?jié)舛瓤梢钥s短孵育時(shí)間。通常一些折衷辦法可使二者兼頤。產(chǎn)生強(qiáng)烈的信號(hào)往往伴有高背景的問題。低濃度試劑產(chǎn)生的背景雖較低，但信號(hào)的強(qiáng)度也相應(yīng)較弱。一般推薦選擇相對(duì)較短的時(shí)間進(jìn)行二抗的孵育（30～60min），并應(yīng)對(duì)標(biāo)記二抗進(jìn)行滴度測(cè)定，使其產(chǎn)生較低背景并形成可接受的信號(hào)強(qiáng)度。總之，抗體應(yīng)該用含高濃度非特異性蛋白的緩沖液稀釋。一般使用牛血清白蛋白（BSA）、胎牛血清（FBS）和脫脂奶粉，或者與標(biāo)記抗體相同種屬的正常血清。
1．對(duì)照
特異性染色反應(yīng)應(yīng)與對(duì)照進(jìn)行比較。地評(píng)價(jià)一種染色模式，應(yīng)該比較來自相同種屬的兩種抗體。對(duì)多克隆抗體來說，的對(duì)照是制備特異性抗體的同一動(dòng)物的免疫前采集的血清，但是，在多數(shù)情況下，相同種屬動(dòng)物的非免疫血清也可以采用。對(duì)單克隆抗體而言，對(duì)照必需是和特異性抗體的來源相同，即細(xì)胞培養(yǎng)上清與上清對(duì)比，小鼠腹水與腹水對(duì)比，或者純化抗體與純化抗體相對(duì)應(yīng)。如果可能，對(duì)照抗體應(yīng)該是特異性抗體的同類或亞類。來自親代的骨髓瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清是不適宜的對(duì)照，因其不含抗體。但來自美國典型培養(yǎng)收藏中心（theAmericantypeculturecollection，ATCC）的適當(dāng)對(duì)照雜交瘤細(xì)胞系是有效的。此外，如果使用間接測(cè)定法，二級(jí)試劑亦應(yīng)經(jīng)過檢測(cè)。當(dāng)使用酶標(biāo)檢測(cè)法時(shí)，應(yīng)該做未加任何抗體的酶反應(yīng)對(duì)照，以證實(shí)某些內(nèi)源性酶反應(yīng)的存在與定位。
2．準(zhǔn)備
對(duì)抗體的結(jié)合和觀察重要的準(zhǔn)備工作是對(duì)一抗和二抗進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定。調(diào)整加入的一抗和二抗的用量，使之能得到有效強(qiáng)度的信號(hào)，而非特異染色較低。一般通過系列稀釋各種抗體來得到這種效果（通常用含蛋白的緩沖液如3％BSA／PBS），并在靶細(xì)胞株同時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)觀察。1：3稀釋可以很快得出一個(gè)合理的結(jié)果。對(duì)各種一抗的準(zhǔn)備，效價(jià)滴定試驗(yàn)應(yīng)該重復(fù)進(jìn)行。而對(duì)二抗效價(jià)滴定后，就可以作為該抗體的使用標(biāo)準(zhǔn)。
3．需要的溶液和試劑
一抗、二抗（多數(shù)為商品來源）、PBS和3％／BSA／PBS。
4．操作步驟
（1）將組織切片或細(xì)胞涂片置于濕盒中。
（2）加入一抗，所有的稀釋必須用含蛋白的溶液。例如，含3％BSA的PBS。單抗一般是雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清（特異性抗體濃度一般用20～50ul／ml）。小鼠腹水，純化的單抗和多抗，粗制的多抗血清應(yīng)該在特異性抗體濃度為0．1～long／m1稀釋范圍內(nèi)檢測(cè)。如果特異抗體濃度是未知的，則將初始材料做1：10，1：100，1：1000，1：10 000稀釋。
（3）將標(biāo)本片置濕盒中，室溫孵育至少30min。對(duì)某些抗原抗體反應(yīng)，延長孵育時(shí)間至24h，可以增加其敏感性。
（4）用PBS洗滌，換液3次，每次>5min。此緩沖液可以補(bǔ)加1％TritonX-100或NP-40，有助于解決背景問題。
（5）加入標(biāo)記的二抗。二抗必須用含有蛋白的溶液如3％／BSA／PBS或1％免疫球蛋白／PBS（來自檢測(cè)試劑的相同種屬）進(jìn)行稀釋。常用的二級(jí)試劑包括酶或膠體金標(biāo)記的抗免疫球蛋白抗體、蛋白A和蛋白G。
酶標(biāo)試劑如果使用商品，檢測(cè)時(shí)二抗的稀釋范圍在1：50～1：1000。堿性磷酸酶標(biāo)記的試劑應(yīng)該用Tris緩沖液稀釋，不可用PBS。
金標(biāo)試劑用PBS洗滌金溶膠顆粒。用含1％明膠的PBS稀釋后加至標(biāo)本上。
（6）將加標(biāo)記二抗的標(biāo)本片放于濕盒中，在室溫至少孵育20min。對(duì)于金標(biāo)試劑，應(yīng)定期在顯微鏡下觀察直至獲得滿意信號(hào)。
（7）更換PBS，漂洗3次，每次5min。
至此，標(biāo)本片即可用于檢測(cè)。
5．常見的問題
如果發(fā)現(xiàn)背景較深，常為非特異性結(jié)合所致，可以用含蛋白液體預(yù)先孵育標(biāo)本而加以抑制。
一般使用的蛋白溶液是3％BSA，10％FBS（胎牛血清，因只含有低濃度的IgG），10％干奶粉或者來自與檢測(cè)試劑相同種屬的純抗體（1％）。阻斷蛋白可以加在各種抗體的準(zhǔn)備階段，也可以在加入抗體前預(yù)先孵育標(biāo)本。
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