由于具有高速度、高分離效果、高靈敏度等優(yōu)點，近年來，HPLC的應(yīng)用發(fā)展非常神速。目前，幾乎所有需要分離的大分子有機(jī)物分析工作，它都可以發(fā)揮優(yōu)勢?？梢灶A(yù)言，HPLC儀器的應(yīng)用，將在“農(nóng)、輕、重、海、陸、空，吃、穿、用"等各個領(lǐng)域、各行各業(yè)、無所不有。
但是，如何用好HPLC是一個非常關(guān)鍵的問題。基于作者的長期實踐，以下從儀器學(xué)理論、分析誤差理論、分析化學(xué)等多個角度來全面討論。
1、泵、柱、檢測器三者的關(guān)系的認(rèn)識和目前使用者普遍存在的問題
目前很多研發(fā)、使用HPLC的科技工作者，沒有搞清楚或沒有搞清楚HPLC中的泵、柱、檢測器三者的關(guān)系。國內(nèi)外很多生產(chǎn)廠商只是生產(chǎn)泵、檢測器，色譜柱子都是外購件。我們說HPLC是一個系統(tǒng)，是指泵、柱、檢測器三者組成的一個完整的系統(tǒng)。如果只生產(chǎn)泵、檢測器，就不能說是生產(chǎn)完整的HPLC儀器，只是生產(chǎn)了HPLC的兩種部件，再買一根色譜柱組裝成一臺儀器后出售。所以，這樣生產(chǎn)的HPLC系統(tǒng)，到了用戶那里，總是不好用或者不大好用。而廣大使用者，由于沒有將HPLC的泵、柱、檢測器三者互相影響的關(guān)系搞清楚，所以不能將HPLC用到水平(得到誤差最小的分析檢測數(shù)據(jù))。以本人長期的研發(fā)和使用HPLC的實踐經(jīng)驗，認(rèn)為研發(fā)、使用HPLC時，以下問題特別值得注重：
正確認(rèn)識、處理HPLC的泵、柱、檢測器三者的關(guān)系：
(1) HPLC是一個系統(tǒng)，必須將泵、柱、檢測器三者(三個部件)結(jié)合起來才能叫HPLC。三者都合格，聯(lián)機(jī)后的整機(jī)系統(tǒng)才有可能合格，但不能肯定系統(tǒng)就會合格。只有泵、柱、檢測器三者質(zhì)量都合格，并且聯(lián)機(jī)后檢測結(jié)果也合格，才能說明這臺HPLC是合格的。
(2) 三個部件都重要，不能偏重哪一方面。三者誰是核心?誰最重要?目前，光譜、色譜工作者對此看法都各不相同、各有表述，我們不必去追究這些。作者認(rèn)為應(yīng)該說三者是一個整體，缺一不可，都很重要。
(3)本人長期使用過HPLC，也研發(fā)過HPLC儀器，實踐使本人深深認(rèn)識到：必須將三個部件聯(lián)接起來檢驗測試，并能達(dá)到質(zhì)量指標(biāo)要求，才能說這臺HPLC達(dá)到了質(zhì)量要求。否則，只能說是部件合格，而整機(jī)系統(tǒng)不一 定能合格。為什么? 因為：
①泵會因為柱子問題產(chǎn)生壓力不穩(wěn)、流量不穩(wěn)定，會影響HPLC系統(tǒng)的質(zhì)量;
?、谥鶎Ρ糜绊懞艽螅褐氯?、柱沾污、柱接頭漏液等，都會影響泵的壓力波動、使流速不穩(wěn)定，會影響系統(tǒng)不穩(wěn)，使RSD變壞、峰拖尾、靈敏度降低;
③柱對檢測器影響很大：柱效降低(柱塔板數(shù)降低)、柱堵塞、柱的新舊程度、接頭、管道漏液等，都會影響檢測器的檢測限、分辨率、噪聲、和靈敏度。
請注意：色譜柱是易損件，用戶會經(jīng)常在色譜柱長時間使用后換新柱，此時HPLC系統(tǒng)的泵和檢測器基本進(jìn)入“電子元件失效理論"的盆底，比較穩(wěn)定了。所以，不會因為換新柱而產(chǎn)生儀器不能使用的問題。特別應(yīng)該指出的是：用戶換新柱后，一般不檢測系統(tǒng)的綜合指標(biāo)。如果檢測指標(biāo)，可能就不能達(dá)到原出廠指標(biāo)(因為泵和檢測器經(jīng)過較長期使用后，質(zhì)量會有所下降，舊泵、新柱、舊檢測器三者不能達(dá)到配備)，但是不會影響使用。
用戶換新柱不會影響使用的問題，可以從計量認(rèn)證標(biāo)準(zhǔn)規(guī)范(JJG)得到佐證。JJG檢驗的儀器，很多是在用儀器，它明確規(guī)定被檢儀器的指標(biāo)可以比新出廠的儀器指標(biāo)低，甚至有些指標(biāo)因為達(dá)不到要求而免檢。但我們的制造企業(yè)，在儀器出廠前，必須檢測系統(tǒng)的指標(biāo)，只有系統(tǒng)指標(biāo)達(dá)到設(shè)計要求時，才算合格，才能出廠。至于用戶換新檢測器、換新泵、同樣都是允許的。
2、使用者應(yīng)該對色譜柱及柱外的有關(guān)問題引起高度重視
1)色譜峰拖尾：與柱、流動相的流速、試樣等有關(guān)，發(fā)現(xiàn)拖尾一定要從這些方面查找原因;
2)如何延長色譜柱壽命：保養(yǎng)很重要，長期不用時用甲醇浸泡著，嚴(yán)格控制洗柱時間或洗柱溶劑體積，一般經(jīng)常使用的柱，下班時應(yīng)該用甲醇(或水：甲醇為20：80)洗 45分鐘或20倍床體積;
3)必須注意對“柱外效應(yīng)"的控制。所謂“柱外效應(yīng)",就是指HPLC系統(tǒng)中，除柱系統(tǒng)外，管路、連接件、進(jìn)樣器和流動池的死體積等引起的色譜峰增寬效應(yīng)。
4) 進(jìn)樣：自動進(jìn)樣時，應(yīng)該經(jīng)常檢測自動進(jìn)樣器，對儀器進(jìn)樣器要求穩(wěn)定可靠;手動進(jìn)樣時，應(yīng)該特別注意取樣時的細(xì)節(jié)，進(jìn)樣時的手感(輕、重、緩、急)等。
3、HPLC的使用者應(yīng)該特別注重對色譜柱質(zhì)量的判斷
1)色譜柱的柱效：塔板數(shù)高者好，特別要注意影響柱效的因素，塔板數(shù)降到一定程度該柱就報廢了。
2)重復(fù)性：一根柱子反復(fù)使用時，RSD能夠保持小于0.1%。
3)耐用性(壽命)：因為柱效很容易降低，所以需要重視對柱的保護(hù)。
4)色譜柱使用后一定要進(jìn)行清洗，以免造成腐蝕、阻塞、降低塔板數(shù)。一般應(yīng)該用20倍床體積沖洗，隔幾天再用的HPLC，用20%甲醇：80%水沖洗30分鐘左右后，再用純甲醇沖洗20分鐘 后保存。
4、HPLC的使用者應(yīng)該特別重視流動相問題
1)PH值特別重要：一般C18柱PH小于3時，容易損壞色譜柱，但是抗酸性的柱可以使用小的PH值。
2) 注意選擇試劑的截止波長：如乙腈截止波長215nm、丙酮截止波長330nm、正丁烷210nm等等(具體情況請讀者參閱本文的參考文獻(xiàn))。
3)流速：流速要適當(dāng)，否則影響峰形、浪費溶劑，一般常規(guī)分析工作大多選擇1ml/min。
5、使用者應(yīng)該注重溶劑前處理
使用HPLC級的優(yōu)質(zhì)溶劑，使用前必須過濾和脫氣。注意以下幾點：
1)過濾目的：
溶劑進(jìn)泵前和樣品注射前應(yīng)該過濾除去溶劑中的微小顆粒、微生物，保證泵和色譜柱不會堵塞或損壞，保證分析數(shù)據(jù)可靠。
2)對過濾器的要求和孔徑選擇方法：
對過濾器總的要求：速度快、溶出度小、死體積小、精確的孔徑、體積適當(dāng)、化學(xué)兼容性好等。
孔徑選擇方法：如果色譜柱填料直徑小于3µm或除菌過濾，一般選擇0.2µm孔徑;如果色譜柱填料直徑大于5µm，則選0.45µm;如果是預(yù)過濾或過濾難過濾的樣品，一般選1µm孔徑。特別是對使用無機(jī)鹽配制的緩沖液，更要注意選擇合適的過濾器!否則，不可能得到可靠的分析測試數(shù)據(jù)!
3)脫氣：
主要目的是：除去流動相中溶解或因混合而產(chǎn)生的氣泡。液相色譜流動相脫氣使用較多的是離線超聲波振蕩脫氣、在線惰性氣體鼓泡吹掃脫氣和在線真空脫氣。流動相的氣泡進(jìn)入液相泵會引起壓力的上下波動，危害很大，必須除之，可以打開排空閥，大流速沖洗。
6、使用者應(yīng)該注重緩沖液問題
1) 緩沖液使用前必須過濾。
2) 溶劑、樣品易受到細(xì)菌和霉菌的影響，要注意清潔。
3)一般不能直接用有機(jī)溶劑做清洗沖洗。
4)梯度洗脫時，選低吸收值的緩沖液 ：
例如：梯度洗脫時，緩沖液與有機(jī)相應(yīng)預(yù)混，以防止析鹽。在保證峰不拖尾的情況下，盡可能選用低濃度的緩沖鹽，防止析鹽; 緩沖鹽濃度，一般用20～30mM基本上就可以了，如果流動相中有機(jī)相含量高的話，流動相中的鹽類緩沖液濃度就不能過高，鹽的濃度起碼要保證在流動相條件下不會析出。離子對緩沖液濃度要高一點，一般50～100mM。
7、研發(fā)者、使用者還特別需要重視12個常見的技術(shù)問題。
這12個問題是作者的經(jīng)驗總結(jié)，是用好HPLC的科技工作者必須重視的問題。(請讀者參考《李昌厚，高效液相色譜儀器及其應(yīng)用，北京：科學(xué)出版社，2014》一書)。
8、使用者必須重視進(jìn)樣器的清洗問題
進(jìn)樣器或進(jìn)樣針請注意三點：
A、對進(jìn)樣器要求：自動進(jìn)樣和取樣速度快、有些儀器進(jìn)樣時間僅17秒。
B、進(jìn)樣室要求可控:一般用帕爾帖冷卻，溫控范圍4℃～100℃。
C、特別要應(yīng)注意進(jìn)樣殘留量的清洗(主要是清洗針)：
洗針后，進(jìn)樣殘留物由前面的0.07% 降到0.05%，結(jié)果非常好。
9、使用者應(yīng)該重視HPLC的線性動態(tài)范圍(Linear Dynanic Range-LDR)及其測試方法
1)線性動態(tài)范圍的定義
HPLC檢測器的線性動態(tài)范圍定義如下圖所示：
國際上科技工作者對HPLC的線性動態(tài)范圍的定義是：線性區(qū)(保證1%相對誤差的線性區(qū)域)的吸光度值A(chǔ)max，除以最小線性區(qū)(保證1%相對誤差的線性區(qū)域)的吸光度值A(chǔ)min。即LDR=Amax/Amin;或線性區(qū)的濃度Cmax除以最小線性區(qū)的濃度Cmin，即LDR=Cmax/Cmin。
2)HPLC的線性動態(tài)范圍的重要性(對分析測試誤差的影響)
定量分析檢測時，如果HPLC使用在非線性動態(tài)區(qū)，肯定會因非線性而產(chǎn)生誤差。為了保證分析測試結(jié)果的可靠性，我們應(yīng)使用在HPLC的線性動態(tài)區(qū)。因此，線性動態(tài)范圍是一切HPLC使用者必須高度重視的技術(shù)指標(biāo)。
一般來說，使用者拿到一臺HPLC儀器后，總是希望對很稀的樣品分析時，其分析測試的結(jié)果在所要求的誤差范圍內(nèi)。對很濃的樣品分析時，其分析測試的結(jié)果也在所要求的誤差范圍內(nèi)。這就只有HPLC的線性動態(tài)范圍很寬的時候才能做到。有人認(rèn)為，樣品太稀時，濃縮一下就好了，樣品太濃時，稀釋一下就是了。這是不了解分析工作或未親自作過分析工作的人說的話。因為，濃縮一下或稀釋一下談何容易?首先是增加工作量，稀釋或濃縮工作很麻煩;第二，稀釋或濃縮會帶來誤差。所以我們總是希望HPLC的線性動態(tài)范圍大(寬)且好。
HPLC的線性動態(tài)范圍，一般取決于儀器檢測器的噪聲和雜散光。國內(nèi)外很多HPLC的生產(chǎn)廠商不給出HPLC的線性動態(tài)范圍。作者認(rèn)為不給線性動態(tài)范圍是不對的，因為不給線性動態(tài)范圍，就意味著不知道這臺HPLC分析的樣品濃度的上限和下限。綜上所述，HPLC的線性動態(tài)范圍非常重要，它將限制儀器的使用范圍(即限制儀器的適用性)。很遺憾的是許多科技工作者目前還未對線性動態(tài)范圍引起重視。
3)線性動態(tài)范圍測試方法
HPLC的線性動態(tài)范圍的測試方法有多種。我國的計量檢定規(guī)程JJG705-2002規(guī)定：波長254nm時，采用“丙酮/2%異丙醇水溶液(丙酮含量為0.1%、0.2%、....1.0%)沖洗檢測池，并記下各溶液對應(yīng)的穩(wěn)定記錄儀讀數(shù);由CH/CL算出檢測器的線性范圍(CH濃度上限、CL濃度下限)。"作者認(rèn)為這種方法很不妥。因為濃度的下限是計算出來的，不是真正測試出來的下限。采用的計算公式為：CL=2NCV/H×20(公式本身有錯誤);并且算出的下限值達(dá)到千萬分之三點一(即：0.000031%)。這樣的數(shù)據(jù)有什么意義?作者認(rèn)為這種測試線性范圍的測試方法既不符合儀器學(xué)理論，又不與國際接軌，有關(guān)部門應(yīng)該盡快更正。
目前，國際上對線性動態(tài)范圍的測試方法，一般是配置不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)樣品(以數(shù)量級遞增)，直接在儀器上測試其吸光度。求出偏離比耳定律1%時的吸光度Amax和最小吸光度Amin。二者相除即是儀器的線性動態(tài)范圍LDR(Linine Dinamic Rangi)。即LDR=Amax/Amin。其具體操作是：HPLC儀器設(shè)置縱坐標(biāo)為吸光度A，橫坐標(biāo)為濃度C;檢測器的光譜帶寬為2nm;波長設(shè)置可以在紫外區(qū)(如要求很高時可設(shè)置在253.7nm)，也可在可見區(qū)(如500nm);試樣可任選，濃度從小到大，依次對所配試樣進(jìn)行測試。作曲線，從曲線上找出偏離線性在1%以內(nèi)的范圍。此范圍內(nèi)的Amax/Amin就是線性動態(tài)范圍。
作者在研發(fā)HPLC的UV/FLD時，就是根據(jù)儀器學(xué)理論，從線性動態(tài)范圍的物理概念出發(fā)，自己配置蒽不同濃度的溶液，以數(shù)量級遞增，測出能保證1%相對誤差的下限點和上限點，二者相除，得出其線性動態(tài)范圍，效果非常好。
