光學(xué)顯微鏡是利用光學(xué)原理,把人眼所不能分辨的微小物體放大成像,以供人們提取微細(xì)結(jié)構(gòu)信息的光學(xué)儀器。
早在公元前一世紀(jì),人們就已發(fā)現(xiàn)通過(guò)球形透明物體去觀察微小物體時(shí),可以使其放大成像。后來(lái)逐漸對(duì)球形玻璃表面能使物體放大成像的規(guī)律有了認(rèn)識(shí)。
1590年,荷蘭和意大利的眼鏡制造者已經(jīng)造出類(lèi)似顯微鏡的放大儀器。1610年前后,意大利的伽利略和德國(guó)的開(kāi)普勒在研究望遠(yuǎn)鏡的同時(shí),改變物鏡和目鏡之間的距離,得出合理的顯微鏡光路結(jié)構(gòu),當(dāng)時(shí)的光學(xué)工匠遂紛紛從事顯微鏡的制造、推廣和改進(jìn)。
17世紀(jì)中葉,英國(guó)的羅伯特.胡克和荷蘭的列文.虎克,都對(duì)顯微鏡的發(fā)展作出了的貢獻(xiàn)。1665年前后,胡克在顯微鏡中加入粗動(dòng)和微動(dòng)調(diào)焦機(jī)構(gòu)、照明系統(tǒng)和承載標(biāo)本片的工作臺(tái)。這些部件經(jīng)過(guò)不斷改進(jìn),成為現(xiàn)代顯微鏡的基本組成部分。
1673~1677年期間,列文胡克制成單組元放大鏡式的高倍顯微鏡,其中九臺(tái)保存至今。胡克和列文胡克利用自制的顯微鏡,在動(dòng)、植物機(jī)體微觀結(jié)構(gòu)的研究方面取得了杰出的成就。
19世紀(jì),高質(zhì)量消色差浸液物鏡的出現(xiàn),使顯微鏡觀察微細(xì)結(jié)構(gòu)的能力大為提高。1827年阿米奇*個(gè)采用了浸液物鏡。19世紀(jì)70年代,德國(guó)人阿貝奠定了顯微鏡成像的古典理論基礎(chǔ)。這些都促進(jìn)了顯微鏡制造和顯微觀察技術(shù)的迅速發(fā)展,并為19世紀(jì)后半葉包括科赫、巴斯德等在內(nèi)的生物學(xué)家和醫(yī)學(xué)家發(fā)現(xiàn)細(xì)菌和微生物提供了有力的工具。
在顯微鏡本身結(jié)構(gòu)發(fā)展的同時(shí),顯微觀察技術(shù)也在不斷創(chuàng)新:1850年出現(xiàn)了偏光顯微術(shù);1893年出現(xiàn)了干涉顯微術(shù);1935年荷蘭物理學(xué)家澤爾尼克創(chuàng)造了相襯顯微術(shù),他為此在1953年獲得了諾貝爾物理學(xué)獎(jiǎng)。
古典的只是光學(xué)元件和精密機(jī)械元件的組合,它以人眼作為接收器來(lái)觀察放大的像。后來(lái)在顯微鏡中加入了攝影裝置,以感光膠片作為可以記錄和存儲(chǔ)的接收器?,F(xiàn)代又普遍采用光電元件、電視攝象管和電荷耦合器等作為顯微鏡的接收器,配以微型電子計(jì)算機(jī)后構(gòu)成完整的圖象信息采集和處理系統(tǒng)。
表面為曲面的玻璃或其他透明材料制成的光學(xué)透鏡可以使物體放大成像,就是利用這一原理把微小物體放大到人眼足以觀察的尺寸。近代的通常采用兩級(jí)放大,分別由物鏡和目鏡完成。被觀察物體位于物鏡的前方,被物鏡作*級(jí)放大后成一倒立的實(shí)象,然后此實(shí)像再被目鏡作第二級(jí)放大,成一虛象,人眼看到的就是虛像。而顯微鏡的總放大倍率就是物鏡放大倍率和目鏡放大倍率的乘積。放大倍率是指直線(xiàn)尺寸的放大比,而不是面積比。
的組成結(jié)構(gòu)
一般由載物臺(tái)、聚光照明系統(tǒng)、物鏡,目鏡和調(diào)焦機(jī)構(gòu)組成。載物臺(tái)用于承放被觀察的物體。利用調(diào)焦旋鈕可以驅(qū)動(dòng)調(diào)焦機(jī)構(gòu),使載物臺(tái)作粗調(diào)和微調(diào)的升降運(yùn)動(dòng),使被觀察物體調(diào)焦清晰成象。它的上層可以在水平面內(nèi)沿作精密移動(dòng)和轉(zhuǎn)動(dòng),一般都把被觀察的部位調(diào)放到視場(chǎng)中
光學(xué)顯微鏡結(jié)構(gòu)
心。
聚光照明系統(tǒng)由燈源和聚光鏡構(gòu)成,聚光鏡的功能是使更多的光能集中到被觀察的部位。照明燈的光譜特性必須與顯微鏡的接收器的工作波段相適應(yīng)。
物鏡位于被觀察物體附近,是實(shí)現(xiàn)*級(jí)放大的鏡頭。在物鏡轉(zhuǎn)換器上同時(shí)裝著幾個(gè)不同放大倍率的物鏡,轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)換器就可讓不同倍率的物鏡進(jìn)入工作光路,物鏡的放大倍率通常為5~100倍。
物鏡是顯微鏡中對(duì)成象質(zhì)量?jī)?yōu)劣起決定性作用的光學(xué)元件。常用的有能對(duì)兩種顏色的光線(xiàn)校正色差的消色差物鏡;質(zhì)量更高的還有能對(duì)三種色光校正色差的復(fù)消色差物鏡;能保證物鏡的整個(gè)像面為平面,以提高視場(chǎng)邊緣成像質(zhì)量的平像場(chǎng)物鏡。高倍物鏡中多采用浸液物鏡,即在物鏡的下表面和標(biāo)本片的上表面之間填充折射率為1.5左右的液體,它能顯著的提高顯微觀察的分辨率。
目鏡是位于人眼附近實(shí)現(xiàn)第二級(jí)放大的鏡頭,鏡放大倍率通常為5~20倍。按照所能看到的視場(chǎng)大小,目鏡可分為視場(chǎng)較小的普通目鏡,和視場(chǎng)較大的大視場(chǎng)目鏡(或稱(chēng)廣角目鏡)兩類(lèi)。
載物臺(tái)和物鏡兩者必須能沿物鏡光軸方向作相對(duì)運(yùn)動(dòng)以實(shí)現(xiàn)調(diào)焦,獲得清晰的圖像。用高倍物鏡工作時(shí),容許的調(diào)焦范圍往往小于微米,所以顯微鏡必須具備極為精密的微動(dòng)調(diào)焦機(jī)構(gòu)。
顯微鏡放大倍率的極限即有效放大倍率,顯微鏡的分辨率是指能被顯微鏡清晰區(qū)分的兩個(gè)物點(diǎn)的Z小間距。分辨率和放大倍率是兩個(gè)不同的但又互有的概念。
當(dāng)選用的物鏡數(shù)值孔徑不夠大,即分辨率不夠高時(shí),顯微鏡不能分清物體的微細(xì)結(jié)構(gòu),此時(shí)即使過(guò)度地增大放大倍率,得到的也只能是一個(gè)輪廓雖大但細(xì)節(jié)不清的圖像,稱(chēng)為無(wú)效放大倍率。反之如果分辨率已滿(mǎn)足要求而放大倍率不足,則顯微鏡雖已具備分辨的能力,但因圖像太小而仍然不能被人眼清晰視見(jiàn)。所以為了充分發(fā)揮顯微鏡的分辨能力,應(yīng)使數(shù)值孔徑與顯微鏡總放大倍率合理匹配。
聚光照明系統(tǒng)是對(duì)顯微鏡成像性能有較大影響,但又是易于被使用者忽視的環(huán)節(jié)。它的功能是提供亮度足夠且均勻的物面照明。聚光鏡發(fā)來(lái)的光束應(yīng)能保證充滿(mǎn)物鏡孔徑角,否則就不能充分利用物鏡所能達(dá)到的Z高分辨率。為此目的,在聚光鏡中設(shè)有類(lèi)似照相物鏡中的 ,可以調(diào)節(jié)開(kāi)孔大小的可變孔徑光闌,用來(lái)調(diào)節(jié)照明光束孔徑,以與物鏡孔徑角匹配。
改變照明方式,可以獲得亮背景上的暗物點(diǎn)(稱(chēng)亮視場(chǎng)照明)或暗背景上的亮物點(diǎn)(稱(chēng)暗視場(chǎng)照明)等不同的觀察方式,以便在不同情況下更好地發(fā)現(xiàn)和觀察微細(xì)結(jié)構(gòu)。