N6-甲基腺苷（m6A）是真核生物中RNA最常見的內部修飾，在多種生物過程，如RNA穩(wěn)定性、剪接、轉運和翻譯中發(fā)揮關鍵調控作用。但檢測所需大量的RNA阻礙了哺乳動物早期胚胎中的m6A分析。本研究通過應用低起始量的甲基RNA免疫沉淀和測序技術（picoMeRIP-seq），成功繪制了小鼠卵母細胞和著床前胚胎中N6-甲基腺苷（m6A）修飾的動態(tài)圖譜，揭示了m6A修飾在調控早期胚胎發(fā)育、基因表達、母體到合子轉換過程中的關鍵作用，以及m6A通過在逆轉錄轉座子衍生的RNA上的富集來維持基因組穩(wěn)定性和細胞特性。為深入理解m6A修飾在哺乳動物早期發(fā)育中的調控機制提供了寶貴的數(shù)據(jù)資源和科學見解。

1.小鼠卵母細胞和早期胚胎中m6A的全局視圖

為了評估m6A修飾的全局水平，作者對處于卵母細胞期（GV）和中期II（MII）階段的卵母細胞，以及處于合子、兩細胞、四細胞、桑椹胚和囊胚階段的早期胚胎進行了m6A的免疫熒光染色，在所有階段都檢測到了m6A的存在。同時利用picoMeRIP-seq技術，在GV、MII、合子、兩細胞、八細胞和囊胚六個階段（每個階段2個生物學重復）生成了全轉錄組范圍的m6A圖譜。平均每個階段識別出11965個m6A峰值，每個階段攜帶m6A修飾的基因數(shù)量分別為5,776（GV）、5,076（MII）、4,579（合子）、4,851（兩細胞）、5,905（八細胞）和6,234（囊胚）。這些m6A峰值在終止密碼子附近顯著富集，并且在所有階段顯示出清晰的RRACH（R=G/A，H=A/C/U）共識基序。進一步通過全轉錄組相關性分析和主成分分析（PCA），結果顯示六個階段一致性均非常高，同時呈現(xiàn)明顯的聚類。這些結果為理解m6A在早期胚胎發(fā)育中的調控作用提供了重要的數(shù)據(jù)基礎。

圖1.小鼠卵母細胞和胚胎的RNA m6A圖譜

2.母體到合子轉換期間的m6A動態(tài)變化

母體到合子轉換期間是哺乳動物胚胎發(fā)育早期的一個關鍵階段，此時胚胎從依賴母體提供的基因產物轉變?yōu)橐蕾囎陨砘虮磉_，在小鼠中該過程發(fā)生在受精后的兩細胞階段。為評估該轉換期間的m6A動態(tài)變化，作者首先定義2個概念，分別是m⁶A+和m⁶A-（一個基因如果其任何轉錄本在給定階段的≥1個生物學重復中與m6A峰值重疊，則為m6A+，否則為m6A-），在6個階段中共有1,579個基因被鑒定為m6A+，同時GO分析表明m6A+和m6A-在功能上有明顯區(qū)別。進一步對6個階段的m6A狀態(tài)進行分析，發(fā)現(xiàn)在合子和兩細胞階段之間觀察到m6A狀態(tài)的顯著變化，與合子相比兩細胞階段有2,356個基因獲得了m6A，2,084個基因失去了m6A。其中，66%的m6A獲得和62%的m6A丟失基因可以通過基因表達重編程來解釋，同時母體RNA降解和合子基因組激活（ZGA）在這一時期同步發(fā)生。

接下來，作者通過香農熵的方法評估了特定階段表達基因的m6A圖譜。共識別了5,996個特定階段表達的基因（分為8組），m6A+的分布范圍在40%~70%不等。整體來看轉錄因子與其它表達基因相比顯示出顯著的m6A富集，并主要集中在與早期胚胎多能性維持和與功能分化有關的主要轉錄調控因子上。其中85%特定階段表達的轉錄因子的mRNA被m6A標記，89%的轉錄因子在至少一個發(fā)育階段存在m6A修飾。表明m6A+基因與轉錄調節(jié)強烈相關，以上分析結果為未來研究探索m6A在早期胚胎發(fā)育中的潛在作用提供了基礎。

圖2.在發(fā)育過程中m6A甲基化動態(tài)的特征分析

3.衰變基因和 ZGA 基因的 m6A 標記和 miRNA 靶向

為了評估m6A修飾在母源性RNA降解及合子基因激活過程中的作用。作者首先識別到2293個母源性降解基因（Decay）與726個合子基因（ZGA）。并根據(jù)受精前后不同的降解模式將Decay分為3個亞群，分別是M-Decay、Z-Decay、C-Decay。其中M-decay基因中m6A+基因的比例小于30%，Z-decay和C-decay基因在卵母細胞中的m6A+基因比例均超過了50%，而在兩細胞階段的ZGA基因m6A+基因比例為46%。進一步通過GO分析，證明m6A+降解基因主要與凋亡、細胞形態(tài)調節(jié)、生殖細胞發(fā)育相關，而m6A+ ZGA基因在胚胎發(fā)生的一系列過程中均顯著富集，包括轉錄調控、細胞增殖和胚胎著床。

之前研究結果已證實mESCs中的miRNA傾向于靶向m6A修飾的區(qū)域。作者想進一步探究miRNA是否靶向m6A+降解基因和ZGA基因，通過與miRNA表達數(shù)據(jù)比較得出，降解基因和ZGA基因中miRNA更傾向于靶向m6A+基因，且降解組中miRNA靶向的m6A+基因比例顯著高于ZGA組。同時發(fā)現(xiàn)miRNA靶向的m6A+基因在降解組和ZGA組中似乎介導相反的功能。以上結果揭示了m6A修飾在小鼠發(fā)育中的重要作用，特別是母體RNA降解、合子基因激活以及與miRNAs相互作用方面。

圖3.在發(fā)育過程中m6A標記和miRNA靶向譜在Decay和ZGA基因上的特征分析

4.m6A沉積于逆轉錄轉座子衍生的RNA上

逆轉錄轉座子是指一類可以通過逆轉錄過程在基因組中移動的DNA片段，主要分為LTR、LINE、SINE三種。先前已有研究表明m6A通過調節(jié)逆轉錄轉座子衍生的RNA分子的穩(wěn)定性和表達，從而影響干細胞的功能和狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)超過50%的m6A峰值與逆轉錄轉座子位點重合，且逆轉錄轉座子位點主要來自ERVL-MaLR、ERVL和L1/LINE-1家族的五個亞家族，包括MTA、ORR1A0、ORR1A1、MERVL和L1Md_T。5個位點在富集時期與程度、分布模式以及富集區(qū)域基序上均存在差異。從富集時期與程度程度來看，MTA在卵母細胞和合子中m6A富集較強，MERVL在兩細胞胚胎中m6A富集較豐富；從分布模式來看MTA序列上的m6A分布相對均勻，而MERVL、L1Md_T、ORR1A0和ORR1A1上的m6A占據(jù)位置有明顯偏好；從富集區(qū)域基序來看GGACU基序在MTA、MERVL、ORR1A0和ORR1A1的m6A富集區(qū)域中頻繁出現(xiàn)，而RRACU基序在所有五個逆轉錄轉座子亞家族的整個序列中都很豐富。以上研究結果證實了m6A修飾在調控逆轉錄轉座子活性在維持基因組穩(wěn)定性和細胞特性發(fā)揮重要作用。

圖4.m6A在逆轉錄病毒衍生的RNA上的沉積

結論

該研究通過使用低輸入甲基RNA免疫沉淀和測序技術，克服了在哺乳動物早期胚胎中進行m6A分析的難題。研究發(fā)現(xiàn)，在從母體到合子轉變的過程中，m6A廣泛存在于母體遺傳的轉錄本和合子激活的基因中，并且這些m6A標記的母體遺傳轉錄本更可能被miRNAs靶向，而特定的逆轉錄轉座子RNA，如MTA和MERVL，也被發(fā)現(xiàn)富含m6A修飾。這些發(fā)現(xiàn)不僅補充哺乳動物卵母細胞和早期胚胎的轉錄組范圍內的m6A圖譜的空白，同時為未來研究m6A在哺乳動物早期胚胎發(fā)育中的調控作用奠定了基礎。