北京創(chuàng)誠致佳科技有限公司
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閱讀：30發(fā)布時間：2024-10-10
在所有科學儀器中，可能沒有比光學顯微鏡更多地投入到其改進中的思想和勞動了。過去幾個世紀以來，它的演變是由希望觀察和測量比以往任何時候都更小、更暗（圖 1）和更深的組織內(nèi)部現(xiàn)象的科學家推動的。
圖 1 - 牛肺動脈上皮細胞
當今改進的顯微鏡產(chǎn)生的圖像示例如圖 1 所示，它說明了使用 CFI60 40X 螢石物鏡和尼康 DXM1200 數(shù)碼相機在Eclipse E600顯微鏡上拍攝的組織培養(yǎng)細胞的數(shù)字捕獲多色熒光圖像。
一個世紀前，顯微鏡達到了經(jīng)典光本質(zhì)理論預(yù)測的分辨率極限。然而，要讓顯微鏡實時檢查活細胞的內(nèi)部運作，需要的不僅僅是分辨率。以前由技術(shù)大師在極少數(shù)實驗室完成的技術(shù)現(xiàn)在簡化為簡單的常規(guī)臨床程序。顯微鏡設(shè)計師仔細聆聽顯微鏡專家的意見，帶來了巨大的創(chuàng)新。本文總結(jié)了顯微鏡設(shè)計的進展，并重點介紹了最近開發(fā)的光學系統(tǒng)如何促進科學進步。
在生物顯微鏡相對簡單的時代，在落射熒光和共聚焦技術(shù)出現(xiàn)之前，幾乎不需要在物鏡和目鏡之間插入厚厚的光學元件 - 透鏡間空間。標準的 160 或 170 毫米管長度，物鏡安裝法蘭和目鏡座之間的距離，很好地適用于此。這些儀器在透鏡間空間具有會聚光。冶金學家和地質(zhì)學家需要偏振光，而在超薄偏振器發(fā)明之前，這需要在該空間中插入大量棱鏡和其他配件。1930 年代的一家制造商，由于標準管中的空間不足，并且由于棱鏡而受到像差校正問題的困擾，因此首先嘗試使用無限遠光學版本來解決這些問題。
術(shù)語“無限遠"意味著物鏡被設(shè)計為將其圖像投影到無限遠，而不是某個有限距離。無限遠光學系統(tǒng)在物鏡和目鏡之間提供平行光區(qū)域。使用這些系統(tǒng)，可以將復(fù)雜的光學組件插入平行光空間中，而不會引入光學像差或減少物鏡的自由工作距離。該系統(tǒng)還保留了物鏡組的齊焦性（圖 2）。在呈現(xiàn)圖2是CFI60光路的概念圖。無限遠光學系統(tǒng)由一個物鏡、一個用于會聚光束的管透鏡和一個目鏡組成。模塊和組件可以放置在物鏡和鏡筒透鏡之間的平行光路中，以創(chuàng)建一個靈活的系統(tǒng)，無需額外的中繼光學器件。像點的位置在軸向和橫向都保持不變，物鏡和管鏡之間的對齊也是如此。
圖 2 - CFI60 光路
當然，為了形成我們可以看到或記錄的圖像，來自無限遠型物鏡的光必須通過平行光空間和目鏡之間的管透鏡或第二個物鏡再次會聚。通常兩個，在一種情況下多達三個，主要光學組件可以放置在這個空間中，而不會降低性能。
現(xiàn)在可以設(shè)計附件和插入的組件以實現(xiàn)精確 1 倍的放大倍率，這在將多種光學技術(shù)與同一樣品進行比較時非常有價值。例如，當安裝用于落射熒光和微分干涉對比 (DIC) 的光學器件時，仍有空間容納第三個設(shè)備 - 放大倍數(shù)轉(zhuǎn)換器、示教頭、用于兩臺攝像機的多端口組件或用于與數(shù)字化墊跟蹤神經(jīng)元。
在多年前的經(jīng)典顯微鏡中，鏡頭設(shè)計者在校正鏡頭像差、球面和色差（軸向和橫向）像差、彗差、散光和場曲時，可以同時考慮物鏡和目鏡。橫向色差 (LCA) 也稱為倍率色差 - 在同一焦平面上形成紅色、綠色和藍色圖像，但每種顏色形成不同大小的圖像。
傳統(tǒng)上，LCA 非常難以校正，并且經(jīng)常在物鏡中未校正，而在目鏡中進行補償。多年前可用的各種光學玻璃和計算技術(shù)不足以完成物鏡內(nèi) LCA 校正的任務(wù)。在未校正的透鏡間光束中插入厚組件將進一步擾亂光學校正。
即使在今天，并非所有制造商都在目標范圍內(nèi)實現(xiàn)了 LCA 的校正。Nikon Inc.（紐約州梅爾維爾）開發(fā)的新型玻璃配方具有極低的色散；因此，所有像差都在物鏡本身內(nèi)得到糾正。該公司于 1976 年推出了款校正的 CF（無色差）物鏡，這項新技術(shù)在 CFI60（無鉻無限遠，60 毫米齊焦肩高）物鏡、套管透鏡和目鏡（尼康）中不斷發(fā)展。在設(shè)計有無限管長度的各種顯微鏡系統(tǒng)中，只有這個系統(tǒng)結(jié)合了充分利用這一概念所需的其他設(shè)計更改。
為無限遠顯微鏡系統(tǒng)設(shè)計理想的物鏡需要比通常數(shù)量更多的透鏡元件，因為出射光束必須聚焦在無限遠。除此之外，還需要熒光技術(shù)，例如 M-FISH（多色熒光原位雜交）（圖 3），它基于收集盡可能多的光子，并且需要更高數(shù)值孔徑 (NA) 的透鏡。除此之外，共聚焦技術(shù)對穿透厚組織的高數(shù)值孔徑、長工作距離透鏡的要求也是如此。為了滿足這些需求，今天的鏡頭必須具有更大物理直徑的玻璃元件。綜上所述，這些要求使舊的鏡片尺寸標準過時了。圖 3 中的示例是成纖維細胞的多色熒光圖像，使用Eclipse E800顯微鏡使用 CFI60 60X、NA 1.4 油浸物鏡在膠片上捕獲。
圖 3 - 熒光原位雜交
英國顯微學會在 1800 年代中期制定的標準設(shè)定了物鏡安裝螺紋的直徑。這個尺寸雖然在當時很慷慨并且適合舊的黃銅顯微鏡，但成為對光學設(shè)計的嚴重限制。此外，以前關(guān)于齊焦肩高的行業(yè)標準——從樣品到物鏡安裝法蘭的距離——被證明不適合當前設(shè)計的復(fù)雜性。這些尺寸的新標準（25 毫米螺紋直徑和 60 毫米齊焦肩高，尼康）使創(chuàng)新的新鏡頭成為可能，并確保有足夠的改進空間。Tube Lens 的焦距為 200 mm，可實現(xiàn)超長工作距離和高 NA 的鏡頭。
所述CFI60透鏡具有更高的NA比通?？捎糜跇藴史糯蟊堵?，提供增加的細節(jié)的分辨率，更高的聚光功率，并在共聚焦應(yīng)用的高性能。Eclipse 儀器的許多物鏡都有一個共同的特性，即工作距離比平常長。這允許從上到下聚焦厚樣品，而不必擔心會破壞蓋玻片或損壞物鏡本身。涂抹浸油更容易，更換樣品也更容易。可以使用厚底腔室，并且可以使用更高倍率的鏡頭進行顯微操作。
在現(xiàn)在揭示細胞內(nèi)部機制和動態(tài)活動的研究中，熒光發(fā)射的每個光子都是寶貴的。以率收集這些需要盡可能高數(shù)值孔徑的物鏡。Plan Fluor 40X NA 1.30 油浸透鏡結(jié)合了放大倍率、高 NA、場平坦度、長工作距離和高紫外線透射率，針對熒光研究的高效工作進行了優(yōu)化。對于等倍放大率的鏡頭，落射照明系統(tǒng)中的圖像亮度與數(shù)值孔徑的四次方成正比。計算表明，將0.65 NA的普通高干鏡片與1.30 NA的40X浸沒鏡片相比，亮度提高了16倍。
許多觀察都是用普通的非浸入式 40X 物鏡進行的，即所謂的高干鏡頭。在這種放大倍數(shù)下，物鏡需要相當高的 NA 才能提供 40 倍放大率應(yīng)顯示的豐富細節(jié)。通常為 40X 鏡頭提供的 NA 為 0.65。即使在這個數(shù)值孔徑下，顯微鏡的光學性能也取決于鏡頭設(shè)計者和制造商無法控制的一個光學組件 - 樣品頂部的蓋玻片。顯微鏡制造商建議使用 0.17 mm 的蓋玻片厚度，并將其刻在物鏡主體上（這對應(yīng)于實驗室供應(yīng)商的 #1 1/2 蓋玻片）。
許多標本是用其他厚度的蓋玻片制備的。這對于低倍率下的觀察影響不大，但在 40X 及更高倍率下卻有很大影響。用鏡頭設(shè)計者的話說，非標準蓋玻片會擾亂物鏡的球面像差；用用戶的話來說，圖像失去對比度，看起來多云。
雖然 0.65 是普通 40X 鏡頭的數(shù)值孔徑，但性能更高的干物鏡可以高達 0.95。這些受到蓋玻片厚度的不利影響，因此必須在物鏡上安裝校正環(huán)。通過在觀察圖像外觀的同時轉(zhuǎn)動它來優(yōu)化圖像質(zhì)量。轉(zhuǎn)動軸環(huán)會改變物鏡某些組件的內(nèi)部間距，不幸的是，這也會改變鏡頭的有效焦距。在實踐中，人們必須同時用一只手轉(zhuǎn)動項圈和另一只手轉(zhuǎn)動微調(diào)旋鈕，同時尋找最清晰的圖像。許多用戶從未掌握這項技術(shù)。高數(shù)值孔徑、高干鏡頭（尼康）的設(shè)計極大地減少了焦點偏移，從而更容易優(yōu)化圖像質(zhì)量。對于高于 0.95 的 NA，提供浸入式鏡頭。
每個制造商都列出了不同的觀察技術(shù)的特殊物鏡，而不是普通的明場技術(shù)——例如相差、DIC 和熒光技術(shù)。使用多種技術(shù)的研究人員曾經(jīng)需要為任何給定的放大倍率購買幾個這樣的物鏡。到目前為止，不可能為這四個目的設(shè)計一個目標而不顯著降低性能。Plan Fluor DLL 鏡頭（尼康）可以在所有四種模式下運行，而不會犧牲圖像質(zhì)量。它們節(jié)省了金錢、便利性和鼻梁架上的空間
在生活中，我們通常首先觀察一個場景，然后放大吸引我們眼球的細節(jié)。在顯微鏡下，我們首先從低倍率開始，然后轉(zhuǎn)向更高倍率。病理學家、神經(jīng)學家和植物學家是眾多生命科學專業(yè)人士中的一員，他們經(jīng)常依靠低功率進行定位并從字面上“了解全局"。然而，在許多顯微鏡上，使用 10X 物鏡和 10X 目鏡的倍率為 100X，與自然尺寸相比有很大的飛躍。由于顯微鏡師通常不愿意更換為低倍目鏡，因此低倍物鏡是低倍率的。
使用 CFI60 0.5X 物鏡，用戶可以在廣闊的視野內(nèi)觀察和拍照。該物鏡的實際視野為 50 毫米，可用于大型標本的宏觀觀察，例如圖 4中所示的椴莖薄片。與傳統(tǒng)的無限遠光學系統(tǒng)相比，物鏡提供的圖像區(qū)域大小是其五倍以上。可以在 35 毫米膠片上進行實際尺寸的攝影。
主要制造商提供了大約的目標。4X、2X 甚至 1X 功率。CFI Macroplan 0.5X 物鏡及其特殊配件在目鏡處呈現(xiàn) 5X 圖像，并將在 35 毫米膠片上拍攝自然尺寸的 1X 圖像（見圖 4）。該鏡頭提供了水平的細節(jié)和色度校正，使顯微鏡能夠提供盡可能寬的放大范圍。
顯微鏡不僅僅是光學器件。它是科學家與身體接觸最多的實驗室儀器。在購買一件可能會坐幾個小時的樂器時，考慮身體舒適度至關(guān)重要。這是在規(guī)格表中無法輕易表達的東西。必須親身體驗。
在許多較舊的顯微鏡中（甚至在一些較新的顯微鏡中），各種控件都放置在制造商的位置。這有時會導致尷尬或不便。
所有主要制造商都在其支架的設(shè)計中考慮了人體工程學因素，但 Eclipse 儀器將人體工程學因素提升到了更高的水平。在設(shè)計中考慮了對用戶如何坐在他們的儀器上的廣泛研究，方便到達距離的測量，以及舒適的手臂和頭部位置的確定。E800 顯微鏡上載物臺手柄和聚焦控制旋鈕的位置與圖 5 (a) 中的傳統(tǒng)顯微鏡進行了比較. 通過保持自然姿勢并使雙手與身體等距，可以減輕壓力。此外，載物臺手柄和微調(diào)焦旋鈕的位置可以用一只手操作，提高了觀察的舒適度。尼康的許多顯微鏡都提供直立和傾斜的目鏡筒（圖 5 (b)），以確保通過在自然位置使用系統(tǒng)來提高檢查效率并提高操作員的舒適度。
此外，向鏡頭間空間添加組件并不總是很容易完成。如果組件只是像大多數(shù)制造商那樣堆疊在一起，雙目觀察頭和目鏡在它們上面，結(jié)果通常是令人不舒服的高觀察布置，用戶伸長脖子通過目鏡觀察。在 Eclipse 中，最多可以將三個組件插入到透鏡間隙中，而無需改變儀器恒定、方便的眼睛位置。
在新的支架中，的控件被放置在顯微鏡師的地方，而不管制造是否容易。相互結(jié)合使用的控件（例如舞臺移動和精細對焦）已放置在可以用同一只手的手指進行調(diào)整的位置。前臂舒適地放在桌面上，的控件自然地落在指尖之下。載物臺的低得多的位置使幻燈片更換方便。舞臺控制裝置可以安裝在任一側(cè)，以便左手或右手操作。
新設(shè)計的支架的其他特性包括大大增強的時間和熱穩(wěn)定性，這對于隨時間推移的研究非常重要，例如有絲分裂研究和胚胎學。還增加了振動阻尼以提高捕獲圖像的分辨率。
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