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閱讀：60發(fā)布時(shí)間：2024-10-10
在所有科學(xué)儀器中，可能沒(méi)有比光學(xué)顯微鏡更多地投入到其改進(jìn)中的思想和勞動(dòng)了。過(guò)去幾個(gè)世紀(jì)以來(lái)，它的演變是由希望觀察和測(cè)量比以往任何時(shí)候都更小、更暗（圖 1）和更深的組織內(nèi)部現(xiàn)象的科學(xué)家推動(dòng)的。
圖 1 - 牛肺動(dòng)脈上皮細(xì)胞
當(dāng)今改進(jìn)的顯微鏡產(chǎn)生的圖像示例如圖 1 所示，它說(shuō)明了使用 CFI60 40X 螢石物鏡和尼康 DXM1200 數(shù)碼相機(jī)在Eclipse E600顯微鏡上拍攝的組織培養(yǎng)細(xì)胞的數(shù)字捕獲多色熒光圖像。
一個(gè)世紀(jì)前，顯微鏡達(dá)到了經(jīng)典光本質(zhì)理論預(yù)測(cè)的分辨率極限。然而，要讓顯微鏡實(shí)時(shí)檢查活細(xì)胞的內(nèi)部運(yùn)作，需要的不僅僅是分辨率。以前由技術(shù)大師在極少數(shù)實(shí)驗(yàn)室完成的技術(shù)現(xiàn)在簡(jiǎn)化為簡(jiǎn)單的常規(guī)臨床程序。顯微鏡設(shè)計(jì)師仔細(xì)聆聽(tīng)顯微鏡專家的意見(jiàn)，帶來(lái)了巨大的創(chuàng)新。本文總結(jié)了顯微鏡設(shè)計(jì)的進(jìn)展，并重點(diǎn)介紹了最近開(kāi)發(fā)的光學(xué)系統(tǒng)如何促進(jìn)科學(xué)進(jìn)步。
在生物顯微鏡相對(duì)簡(jiǎn)單的時(shí)代，在落射熒光和共聚焦技術(shù)出現(xiàn)之前，幾乎不需要在物鏡和目鏡之間插入厚厚的光學(xué)元件 - 透鏡間空間。標(biāo)準(zhǔn)的 160 或 170 毫米管長(zhǎng)度，物鏡安裝法蘭和目鏡座之間的距離，很好地適用于此。這些儀器在透鏡間空間具有會(huì)聚光。冶金學(xué)家和地質(zhì)學(xué)家需要偏振光，而在超薄偏振器發(fā)明之前，這需要在該空間中插入大量棱鏡和其他配件。1930 年代的一家制造商，由于標(biāo)準(zhǔn)管中的空間不足，并且由于棱鏡而受到像差校正問(wèn)題的困擾，因此首先嘗試使用無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)版本來(lái)解決這些問(wèn)題。
術(shù)語(yǔ)“無(wú)限遠(yuǎn)"意味著物鏡被設(shè)計(jì)為將其圖像投影到無(wú)限遠(yuǎn)，而不是某個(gè)有限距離。無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)在物鏡和目鏡之間提供平行光區(qū)域。使用這些系統(tǒng)，可以將復(fù)雜的光學(xué)組件插入平行光空間中，而不會(huì)引入光學(xué)像差或減少物鏡的自由工作距離。該系統(tǒng)還保留了物鏡組的齊焦性（圖 2）。在呈現(xiàn)圖2是CFI60光路的概念圖。無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)由一個(gè)物鏡、一個(gè)用于會(huì)聚光束的管透鏡和一個(gè)目鏡組成。模塊和組件可以放置在物鏡和鏡筒透鏡之間的平行光路中，以創(chuàng)建一個(gè)靈活的系統(tǒng)，無(wú)需額外的中繼光學(xué)器件。像點(diǎn)的位置在軸向和橫向都保持不變，物鏡和管鏡之間的對(duì)齊也是如此。
圖 2 - CFI60 光路
當(dāng)然，為了形成我們可以看到或記錄的圖像，來(lái)自無(wú)限遠(yuǎn)型物鏡的光必須通過(guò)平行光空間和目鏡之間的管透鏡或第二個(gè)物鏡再次會(huì)聚。通常兩個(gè)，在一種情況下多達(dá)三個(gè)，主要光學(xué)組件可以放置在這個(gè)空間中，而不會(huì)降低性能。
現(xiàn)在可以設(shè)計(jì)附件和插入的組件以實(shí)現(xiàn)精確 1 倍的放大倍率，這在將多種光學(xué)技術(shù)與同一樣品進(jìn)行比較時(shí)非常有價(jià)值。例如，當(dāng)安裝用于落射熒光和微分干涉對(duì)比 (DIC) 的光學(xué)器件時(shí)，仍有空間容納第三個(gè)設(shè)備 - 放大倍數(shù)轉(zhuǎn)換器、示教頭、用于兩臺(tái)攝像機(jī)的多端口組件或用于與數(shù)字化墊跟蹤神經(jīng)元。
在多年前的經(jīng)典顯微鏡中，鏡頭設(shè)計(jì)者在校正鏡頭像差、球面和色差（軸向和橫向）像差、彗差、散光和場(chǎng)曲時(shí)，可以同時(shí)考慮物鏡和目鏡。橫向色差 (LCA) 也稱為倍率色差 - 在同一焦平面上形成紅色、綠色和藍(lán)色圖像，但每種顏色形成不同大小的圖像。
傳統(tǒng)上，LCA 非常難以校正，并且經(jīng)常在物鏡中未校正，而在目鏡中進(jìn)行補(bǔ)償。多年前可用的各種光學(xué)玻璃和計(jì)算技術(shù)不足以完成物鏡內(nèi) LCA 校正的任務(wù)。在未校正的透鏡間光束中插入厚組件將進(jìn)一步擾亂光學(xué)校正。
即使在今天，并非所有制造商都在目標(biāo)范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)了 LCA 的校正。Nikon Inc.（紐約州梅爾維爾）開(kāi)發(fā)的新型玻璃配方具有極低的色散；因此，所有像差都在物鏡本身內(nèi)得到糾正。該公司于 1976 年推出了款校正的 CF（無(wú)色差）物鏡，這項(xiàng)新技術(shù)在 CFI60（無(wú)鉻無(wú)限遠(yuǎn)，60 毫米齊焦肩高）物鏡、套管透鏡和目鏡（尼康）中不斷發(fā)展。在設(shè)計(jì)有無(wú)限管長(zhǎng)度的各種顯微鏡系統(tǒng)中，只有這個(gè)系統(tǒng)結(jié)合了充分利用這一概念所需的其他設(shè)計(jì)更改。
為無(wú)限遠(yuǎn)顯微鏡系統(tǒng)設(shè)計(jì)理想的物鏡需要比通常數(shù)量更多的透鏡元件，因?yàn)槌錾涔馐仨毦劢乖跓o(wú)限遠(yuǎn)。除此之外，還需要熒光技術(shù)，例如 M-FISH（多色熒光原位雜交）（圖 3），它基于收集盡可能多的光子，并且需要更高數(shù)值孔徑 (NA) 的透鏡。除此之外，共聚焦技術(shù)對(duì)穿透厚組織的高數(shù)值孔徑、長(zhǎng)工作距離透鏡的要求也是如此。為了滿足這些需求，今天的鏡頭必須具有更大物理直徑的玻璃元件。綜上所述，這些要求使舊的鏡片尺寸標(biāo)準(zhǔn)過(guò)時(shí)了。圖 3 中的示例是成纖維細(xì)胞的多色熒光圖像，使用Eclipse E800顯微鏡使用 CFI60 60X、NA 1.4 油浸物鏡在膠片上捕獲。
圖 3 - 熒光原位雜交
英國(guó)顯微學(xué)會(huì)在 1800 年代中期制定的標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定了物鏡安裝螺紋的直徑。這個(gè)尺寸雖然在當(dāng)時(shí)很慷慨并且適合舊的黃銅顯微鏡，但成為對(duì)光學(xué)設(shè)計(jì)的嚴(yán)重限制。此外，以前關(guān)于齊焦肩高的行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)——從樣品到物鏡安裝法蘭的距離——被證明不適合當(dāng)前設(shè)計(jì)的復(fù)雜性。這些尺寸的新標(biāo)準(zhǔn)（25 毫米螺紋直徑和 60 毫米齊焦肩高，尼康）使創(chuàng)新的新鏡頭成為可能，并確保有足夠的改進(jìn)空間。Tube Lens 的焦距為 200 mm，可實(shí)現(xiàn)超長(zhǎng)工作距離和高 NA 的鏡頭。
所述CFI60透鏡具有更高的NA比通?？捎糜跇?biāo)準(zhǔn)放大倍率，提供增加的細(xì)節(jié)的分辨率，更高的聚光功率，并在共聚焦應(yīng)用的高性能。Eclipse 儀器的許多物鏡都有一個(gè)共同的特性，即工作距離比平常長(zhǎng)。這允許從上到下聚焦厚樣品，而不必?fù)?dān)心會(huì)破壞蓋玻片或損壞物鏡本身。涂抹浸油更容易，更換樣品也更容易。可以使用厚底腔室，并且可以使用更高倍率的鏡頭進(jìn)行顯微操作。
在現(xiàn)在揭示細(xì)胞內(nèi)部機(jī)制和動(dòng)態(tài)活動(dòng)的研究中，熒光發(fā)射的每個(gè)光子都是寶貴的。以率收集這些需要盡可能高數(shù)值孔徑的物鏡。Plan Fluor 40X NA 1.30 油浸透鏡結(jié)合了放大倍率、高 NA、場(chǎng)平坦度、長(zhǎng)工作距離和高紫外線透射率，針對(duì)熒光研究的高效工作進(jìn)行了優(yōu)化。對(duì)于等倍放大率的鏡頭，落射照明系統(tǒng)中的圖像亮度與數(shù)值孔徑的四次方成正比。計(jì)算表明，將0.65 NA的普通高干鏡片與1.30 NA的40X浸沒(méi)鏡片相比，亮度提高了16倍。
許多觀察都是用普通的非浸入式 40X 物鏡進(jìn)行的，即所謂的高干鏡頭。在這種放大倍數(shù)下，物鏡需要相當(dāng)高的 NA 才能提供 40 倍放大率應(yīng)顯示的豐富細(xì)節(jié)。通常為 40X 鏡頭提供的 NA 為 0.65。即使在這個(gè)數(shù)值孔徑下，顯微鏡的光學(xué)性能也取決于鏡頭設(shè)計(jì)者和制造商無(wú)法控制的一個(gè)光學(xué)組件 - 樣品頂部的蓋玻片。顯微鏡制造商建議使用 0.17 mm 的蓋玻片厚度，并將其刻在物鏡主體上（這對(duì)應(yīng)于實(shí)驗(yàn)室供應(yīng)商的 #1 1/2 蓋玻片）。
許多標(biāo)本是用其他厚度的蓋玻片制備的。這對(duì)于低倍率下的觀察影響不大，但在 40X 及更高倍率下卻有很大影響。用鏡頭設(shè)計(jì)者的話說(shuō)，非標(biāo)準(zhǔn)蓋玻片會(huì)擾亂物鏡的球面像差；用用戶的話來(lái)說(shuō)，圖像失去對(duì)比度，看起來(lái)多云。
雖然 0.65 是普通 40X 鏡頭的數(shù)值孔徑，但性能更高的干物鏡可以高達(dá) 0.95。這些受到蓋玻片厚度的不利影響，因此必須在物鏡上安裝校正環(huán)。通過(guò)在觀察圖像外觀的同時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)它來(lái)優(yōu)化圖像質(zhì)量。轉(zhuǎn)動(dòng)軸環(huán)會(huì)改變物鏡某些組件的內(nèi)部間距，不幸的是，這也會(huì)改變鏡頭的有效焦距。在實(shí)踐中，人們必須同時(shí)用一只手轉(zhuǎn)動(dòng)項(xiàng)圈和另一只手轉(zhuǎn)動(dòng)微調(diào)旋鈕，同時(shí)尋找最清晰的圖像。許多用戶從未掌握這項(xiàng)技術(shù)。高數(shù)值孔徑、高干鏡頭（尼康）的設(shè)計(jì)極大地減少了焦點(diǎn)偏移，從而更容易優(yōu)化圖像質(zhì)量。對(duì)于高于 0.95 的 NA，提供浸入式鏡頭。
每個(gè)制造商都列出了不同的觀察技術(shù)的特殊物鏡，而不是普通的明場(chǎng)技術(shù)——例如相差、DIC 和熒光技術(shù)。使用多種技術(shù)的研究人員曾經(jīng)需要為任何給定的放大倍率購(gòu)買幾個(gè)這樣的物鏡。到目前為止，不可能為這四個(gè)目的設(shè)計(jì)一個(gè)目標(biāo)而不顯著降低性能。Plan Fluor DLL 鏡頭（尼康）可以在所有四種模式下運(yùn)行，而不會(huì)犧牲圖像質(zhì)量。它們節(jié)省了金錢、便利性和鼻梁架上的空間
在生活中，我們通常首先觀察一個(gè)場(chǎng)景，然后放大吸引我們眼球的細(xì)節(jié)。在顯微鏡下，我們首先從低倍率開(kāi)始，然后轉(zhuǎn)向更高倍率。病理學(xué)家、神經(jīng)學(xué)家和植物學(xué)家是眾多生命科學(xué)專業(yè)人士中的一員，他們經(jīng)常依靠低功率進(jìn)行定位并從字面上“了解全局"。然而，在許多顯微鏡上，使用 10X 物鏡和 10X 目鏡的倍率為 100X，與自然尺寸相比有很大的飛躍。由于顯微鏡師通常不愿意更換為低倍目鏡，因此低倍物鏡是低倍率的。
使用 CFI60 0.5X 物鏡，用戶可以在廣闊的視野內(nèi)觀察和拍照。該物鏡的實(shí)際視野為 50 毫米，可用于大型標(biāo)本的宏觀觀察，例如圖 4中所示的椴莖薄片。與傳統(tǒng)的無(wú)限遠(yuǎn)光學(xué)系統(tǒng)相比，物鏡提供的圖像區(qū)域大小是其五倍以上。可以在 35 毫米膠片上進(jìn)行實(shí)際尺寸的攝影。
主要制造商提供了大約的目標(biāo)。4X、2X 甚至 1X 功率。CFI Macroplan 0.5X 物鏡及其特殊配件在目鏡處呈現(xiàn) 5X 圖像，并將在 35 毫米膠片上拍攝自然尺寸的 1X 圖像（見(jiàn)圖 4）。該鏡頭提供了水平的細(xì)節(jié)和色度校正，使顯微鏡能夠提供盡可能寬的放大范圍。
顯微鏡不僅僅是光學(xué)器件。它是科學(xué)家與身體接觸最多的實(shí)驗(yàn)室儀器。在購(gòu)買一件可能會(huì)坐幾個(gè)小時(shí)的樂(lè)器時(shí)，考慮身體舒適度至關(guān)重要。這是在規(guī)格表中無(wú)法輕易表達(dá)的東西。必須親身體驗(yàn)。
在許多較舊的顯微鏡中（甚至在一些較新的顯微鏡中），各種控件都放置在制造商的位置。這有時(shí)會(huì)導(dǎo)致尷尬或不便。
所有主要制造商都在其支架的設(shè)計(jì)中考慮了人體工程學(xué)因素，但 Eclipse 儀器將人體工程學(xué)因素提升到了更高的水平。在設(shè)計(jì)中考慮了對(duì)用戶如何坐在他們的儀器上的廣泛研究，方便到達(dá)距離的測(cè)量，以及舒適的手臂和頭部位置的確定。E800 顯微鏡上載物臺(tái)手柄和聚焦控制旋鈕的位置與圖 5 (a) 中的傳統(tǒng)顯微鏡進(jìn)行了比較. 通過(guò)保持自然姿勢(shì)并使雙手與身體等距，可以減輕壓力。此外，載物臺(tái)手柄和微調(diào)焦旋鈕的位置可以用一只手操作，提高了觀察的舒適度。尼康的許多顯微鏡都提供直立和傾斜的目鏡筒（圖 5 (b)），以確保通過(guò)在自然位置使用系統(tǒng)來(lái)提高檢查效率并提高操作員的舒適度。
此外，向鏡頭間空間添加組件并不總是很容易完成。如果組件只是像大多數(shù)制造商那樣堆疊在一起，雙目觀察頭和目鏡在它們上面，結(jié)果通常是令人不舒服的高觀察布置，用戶伸長(zhǎng)脖子通過(guò)目鏡觀察。在 Eclipse 中，最多可以將三個(gè)組件插入到透鏡間隙中，而無(wú)需改變儀器恒定、方便的眼睛位置。
在新的支架中，的控件被放置在顯微鏡師的地方，而不管制造是否容易。相互結(jié)合使用的控件（例如舞臺(tái)移動(dòng)和精細(xì)對(duì)焦）已放置在可以用同一只手的手指進(jìn)行調(diào)整的位置。前臂舒適地放在桌面上，的控件自然地落在指尖之下。載物臺(tái)的低得多的位置使幻燈片更換方便。舞臺(tái)控制裝置可以安裝在任一側(cè)，以便左手或右手操作。
新設(shè)計(jì)的支架的其他特性包括大大增強(qiáng)的時(shí)間和熱穩(wěn)定性，這對(duì)于隨時(shí)間推移的研究非常重要，例如有絲分裂研究和胚胎學(xué)。還增加了振動(dòng)阻尼以提高捕獲圖像的分辨率。
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