針對MERS的疫苗優(yōu)化研究
中東呼吸綜合征冠狀病毒(MERS-CoV)，是近年來第二個造成大規(guī)模人群傳染的冠狀病毒，相較于SARS病毒，其致死率高、發(fā)病快，因此急需研發(fā)有效的疫苗用于被動免疫。在2015年由NIH的Barney S. Graham主導的研究中，科學家評價和比較了靶向MERS的多種疫苗方案[2]。
基于DNA和蛋白為免疫原的免疫流程，圖片源自參考資料2。
圍繞MERS冠狀病毒的刺突蛋白(S)，研究構建了多種cDNA和蛋白免疫原，分別通過電轉和配合佐劑的形式免疫小鼠。為了提升研究的安全性，科學家建立了帶有化學發(fā)光報告基因的假病毒體系。通過檢測由病毒感染所致的化學發(fā)光，研究利用可溶性DPP4(MERS 靶點)和DPP4抗體驗證了假病毒的功能。
MERS假病毒功能性驗證，左圖：基于過表達技術驗證DPP4過表達提升病毒的感染能力，Huh7.5內源性高表達DPP4。中圖：基于可溶性DPP4的競爭實驗。右圖：利用DPP4抗體抑制假病毒的感染。假病毒的化學發(fā)光檢測基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平臺。圖片源自參考資料2。
借助假病毒體系，研究追蹤和評價了不同免疫策略產生的血清的中和能力和針對多種MERS病毒株的交叉中和能力。從結果可以看出，全程S1蛋白和2X S DNA-S1蛋白的免疫方案所獲得的抗體較為有效，且能中和多種MERS病毒株。通過進一步的競爭實驗和血清吸附實驗，研究證實不同的免疫流程得到的血清靶向的S蛋白位置也不一樣。與經典的微量中和實驗(Microneutralization)相比，研究證實假病毒體系評價抗體中和能力更為敏感，靈敏度約有一個數量級的提升。通過解析抗體的亞型，研究發(fā)現基于S DNA的免疫方案能誘導IgG2a為主導的免疫反應，而S1蛋白刺激則產生IgG1為主導的免疫反應。在小鼠中，IgG2a的出現反映了Th1型免疫反應，促進了抗病毒相關因子如interferon-γ的釋放，提升了T細胞介導的抗病毒反應。因此，相較于蛋白，基于DNA的疫苗可以通過建立T輔助細胞免疫應答來更有效的控制病毒感染。
血清的交叉中和能力檢測。假病毒的化學發(fā)光檢測基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平臺。圖片源自參考資料2。
對應的，在非人靈長類動物(印度恒河猴)模型上，全程S1蛋白和2X S DNA-S1蛋白的免疫方案產生的中和抗體滴度*于基于全程DNA的免疫方案。病毒接種后，相較于對照組，免疫組動物顯著降低肺部病理指標。疫苗中DNA免疫原的引入更是進一步緩解肺部的損傷情況，并加速了康復過程。
基于非人靈長類動物(印度恒河猴)模型的疫苗評價。上圖：免疫流程。下左圖：動物血清中和實驗，基于96-well white/black Isoplate微孔板和Microbeta平臺。下右圖：通過CT評價疫苗的保護作用。圖片源自參考資料2。
No.2基于轉基因牛的抗病毒血清研究
在抗擊SARS和流感的臨床療法中，“恢復期血漿”治療(Convalescent?phase plasma therapy)獲得了一定的成效，有效降低了死亡率。但是，該法的療效很大程度上依賴于是否能及時獲得有效的血清。相比下，基于動物的超免疫血清雖然能解決量的問題，但其使用可能會導致嚴重的免疫反應和毒性。單克隆抗體療法，又一種基于被動免疫的治療方法，面臨耗時長和出現耐藥突變病毒株等挑戰(zhàn)。
為了解決上述的問題，有研究人員將目光轉向了轉基因牛(Transchromosomic (Tc) bovines)來快速獲得大量、有效的抗病毒血清。通過基因工程，研究人員敲除牛自身的IgG，并引入完整的、可IgG亞型人抗體表達體系，來達到免疫系統(tǒng)人源化的效果。免疫后的牛每只每月可提供高達150到600 g的人IgG。目前，已有多項臨床前研究利用該技術對抗MERS和Ebola等傳染病[3,4]。在此，我們著重介紹靶向MERS的研究。
在免疫原段，該研究利用了兩種材料：滅活的Jordan病毒株(WKVV)和基于Al-Hasa病毒株S蛋白的納米材料(SPNV)。兩種免疫原均能刺激產生S蛋白特異的血清和人IgG(SAB-300/301)?；诎踩院蜕a可行性等因素，研究主要圍繞基于SPNV產生的人IgG開展動物和臨床研究。
上圖：基于轉基因牛的免疫過程。下圖：利用Anti-Spike抗體檢測所得血清(左)和純化人IgG(右)的有效含量。圖片源自參考資料3。
除了特異性檢測外，研究利用免疫熒光成像技術，結合Anti-Spike抗體來衡量免疫所得血清和抗體的抗病毒中和作用(FRNA50)。相較于只能完成一輪感染的假病毒體系，FRNA50能直觀、全面地反映藥物處理對于病毒感染能力的影響。在該研究中，此法還結合mRNA檢測驗證病毒的滅活效果，確保疫苗的安全性。結合FRNA50和傳統(tǒng)的半數組織培養(yǎng)感染量(Tissue culture infectious dose-50%,TCID50)測定法，研究證明純化的血清含有高水平的中和多抗。在過表達DPP4的小鼠模型上，無論是預防性還是治療性給藥，SAB-301都能有效的控制肺部的病毒量。在安全性上，SAB-301不支持抗體依賴的病毒感染增強作用(Antibody-dependent enhancement,ADE)。目前，由SAB Biotherapeutics公司推出的SAB-301已進入一期臨床試驗。
利用FRNA50檢測所得血清(左)和純化人IgG(右)靶向MERS病毒的中和能力。FRNA50基于Operetta高內涵平臺和配套微孔板。圖片源自參考資料3。
No.3利用ADCC抗擊H7N9禽流感的單抗研究
作為腫瘤免疫療法的主要推動者，單克隆抗體(單抗)也被廣泛用于抗擊SARS和HIV等多種病毒的研究中。此外，基于HIV-1和流感中和單抗的研究也為疫苗設計提供了新的思路。但是，基于雜交瘤技術的傳統(tǒng)單抗制備面臨著耗時長，步驟多且繁瑣等問題，限制了其對可能出現的新型疫情爆發(fā)的應對能力。相比下，噬菌體展示技術為快讀獲得高親和力人源單抗提供了新的途徑?；谠摷夹g平臺，復旦大學研究人員建立超大型天然全人源抗體庫，并成功鑒定靶向MERS和流感的強力抗體[5,6]。
在抗擊H7N9流感的工作中，為了獲得低突變的高特異抗體，研究人員以重組表達的HA和HA1蛋白為抗原，基于健康人B細胞來源的天然抗體庫開展多輪篩選，獲得單抗m826。經序列分析，研究人員證明m826與胚系基因高度同源，是胚系抗體。相較于體細胞高度突變的抗體，胚系抗體建立時間短，安全性高且成藥性更好，適用于靶向急性感染的抗體和疫苗研發(fā)。
基于噬菌體展示技術的H7N9抗體篩選，圖片源自參考資料6。
非常有意思的是，在紅細胞凝集抑制 (Hemagglutination inhibition,HI)反應中，m826僅表現出微弱的抗病毒能力。進一步的細胞病變效應(Cytopathic effect,CPE)檢測和免疫熒光法中和實驗證明m826不能中和流感病毒，抑制其在靶細胞的增殖。利用親脂性熒光染料R18和SP-DiOC18(3)來標記病毒，研究發(fā)現m826對病毒與靶細胞的結合和膜融合過程無顯著影響。但是，m826能很強結合表達H7N9 HA蛋白的細胞，是ADCC(Antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity，抗體依賴的細胞介導的細胞毒性作用)活力的強力介導者。同時，由于不能中和H7N9病毒，m826還能成為高價值的工具性抗體。在動物模型上，IgG1 m826能有效的預防和控制H7N9的感染。因此，m826依賴于ADCC，而不是中和能力抗擊流感病毒。這一發(fā)現為抗病毒抗體的篩選和研發(fā)提供了新的思路和途徑。
左圖：基于免疫熒光成像技術(熒光標記病毒)的中和實驗，H7N4抗體為中和陽性對照。右上：病毒結合檢測，紅色熒光探針R18標記病毒，感染30分鐘后進行成像檢測。NA為結合陰性對照；m336為陰性對照抗體。右下：利用熒光探針R18和SP-DiOC18(3)雙標記病毒，病毒膜融合發(fā)生會誘導SP-DiOC18(3)綠色熒光信號加強。Baf A1為融合陰性對照。上述高通量成像檢測均基于Opera或Operetta高內涵平臺。圖片源自參考資料6。
No.4靶向膜融合的廣譜抗病毒多肽研究
作為動物來源的病毒，冠狀病毒因其多樣性，較高的傳播能力和進化能力限制了單一的靶向療法的臨床應用。因此，從長遠角度來看，能作用于多種冠狀病毒的新型廣譜抗病毒藥物，會成為抗擊流行性和新型冠狀病毒感染的武器。相較于高度變異的受體結合區(qū)(Receptor-binding domain, RBD)，病毒膜融合涉及的Heptad repeat (HR)區(qū)高度保守。同時膜融合也是病毒感染和復制重要的功能性過程。因此，該區(qū)域成為了抑制性多肽的研究重點。靶向冠狀病毒的膜融合過程，來自于復旦大學的研究團隊研發(fā)出廣譜多肽抑制劑EK1，為抗擊冠狀病毒和類似病毒提供了新的大分子治療策略[7]。
冠狀病毒可通過胞內體膜融合途徑(Endosomal pathway)或/和細胞表面胞漿膜融合途徑(Non-endosomal pathway)進入細胞。病毒通過結合宿主細胞受體激活其S2亞基的HR1和HR2區(qū)，互相結合形成對膜融合至關重要的6-HB(Six-helix bundle)結構。
冠狀病毒的膜融合過程和競爭性多肽工作機制，圖片源自參考資料7。
鑒于此，研究人員以多種冠狀病毒的保守HR區(qū)為模板，合成HR1和HR2區(qū)來源的多肽(HR1P和HR2P)用于競爭。通過過表達技術，研究進一步建立靶向多種冠狀病毒的細胞細胞融合實驗，系統(tǒng)性篩查HR1P和HR2P對細胞融合的抑制。結果顯示由OC43株來源的HR2P具有廣譜且強效的抑制融合能力。在此基礎上，研究人員通過引入氨基酸和突變等方法，進一步優(yōu)化多肽的可溶性和成藥性。所獲得的多肽EK1，在進一步的一系列體外檢測，包括細胞細胞融合實驗，假病毒法，Blam-Vpr法和活病毒增殖能力檢測中，都表現出強效的廣譜抗病毒能力。
細胞細胞融合實驗，過表達病毒S蛋白并帶有GFP信號的293T細胞為作用細胞，Huh-7為靶細胞，圖片源自參考資料7。
除了可以用于免疫缺陷和老年患者外，多肽類藥物的另一優(yōu)勢是支持非侵入性鼻腔給藥，適合用于靶向呼吸道的病毒感染。因此，檢測鼻腔給藥下的EK1的體內分布非常重要?；诨铙w成像技術，研究觀察到Cy5熒光標記的EK1可廣泛分布于整個呼吸道中，并集中在肺部。此外，一些肺外的器官，包括肝臟、腎和脾，都能檢測到EK1的分布，表明EK1可以進入血液循環(huán)系統(tǒng)和其他臟器中。因此，EK1還可能作用于由冠狀病毒導致的系統(tǒng)性或多器官感染。在OC43和MERS感染小鼠模型上，EK1均表現出強力的抗病毒能力，有效抑制了因感染帶來的體重減輕和死亡現象。從體外到體內的多方面安全性評價表明通過鼻腔給藥的EK1是低免疫原性，安全的治療策略。因此，EK1是一個新型、有潛力的廣譜抗冠狀病毒藥物，值得進一步的深入研究。
上：基于活體成像檢測鼻腔給藥下Cy5標記的EK1在小鼠體內的分布；小動物活體成像檢測基于IVIS平臺。下：EK1處理對模型鼠死亡率、體重和病毒滴度的影響，圖片源自參考資料7。
總結
通過上述四個案例，我們總體介紹了靶向病毒段的大分子療法的研究流程和關注點。助力此類治療方法的研發(fā)，珀金埃爾默提供成熟的整體應用解決方案。針對攜帶螢火蟲報告基因的假病毒研究，我們提供全面、配套的涵蓋化學發(fā)光試劑，微孔板和高通量檢測平臺的解決方案。對于基于慢病毒包裝系統(tǒng)的假病毒，我們還可以提供p24檢測解決方案，用于快速衡量病毒的感染能力。此外，基于成像平臺的解決方案，我們還可以分析短程和長程的復雜亞細胞活動，例如由病毒介導的膜融合過程。在血清和抗體的篩查和分析中，強大的高內涵解決方案能更大程度發(fā)揮表型篩選的優(yōu)勢，發(fā)現具有中和能力、安全的潛在抗體。同時，ADCC，作為關鍵的抗感染抗體工作機制之一，也是我們的主要應用關注點。針對ADCC的檢測，我們提供金標準、靈活的放射和非放射解決方案，助力抗體類藥物的深入評價[8]。然后，在臨床前動物研究中，除了中和檢測外，我們提供覆蓋功能到結構的活體成像解決方案，助力病理檢測、藥物分析和藥效評價等核心工作。
參考文獻
1. 藥物機制解讀 | “人民的希望”抗病毒藥物瑞德西韋(Remdesivir)
2. Wang L, et al. Evaluation of candidate vaccine approaches for MERS-CoV. Nat Commun. 2015 Jul 28;6:7712.
3. Luke T, et al. Human polyclonal immunoglobulin G from transchromosomic bovines inhibits MERS-CoV in vivo. Sci Transl Med. 2016 Feb 17;8(326):326ra21.
4. Thomas Luke, et al. Fully Human Immunoglobulin G From Transchromosomic Bovines Treats Nonhuman Primates Infected With Ebola Virus Makona Isolate. J Infect Dis. 2018 Dec 15; 218(Suppl 5): S636–S648.
5. Ying T, et al. Junctional and allele-specific residues are critical for MERS-CoV neutralization by an exceptionally potent germline-like antibody. Nat Commun. 2015 Sep 15;6:8223.
6. Fei Yu,et al. A potent germline-like human monoclonal antibody targets a pH-sensitive epitope on H7N9 influenza hemagglutinin. Cell Host Microbe. 2017 Oct 11; 22(4): 471–483.e5.
7. Shuai Xia,et al. A pan-coronavirus fusion inhibitor targeting the HR1 domain of human coronavirus spike. Sci Adv. 2019 Apr; 5(4): eaav4580
8. DELFIA經典技術應用于單抗研發(fā)及細胞治療——AD0116細胞殺傷專題之ADCChttps://mp.weixin.qq.com/s/0lkBdDHL5MFIyoeoFV4wWQ
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