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背景介紹: CAR-T療法風(fēng)潮

基于Chimeric antigen receptor T cells (CAR-T)技術(shù)的細(xì)胞治療可謂是當(dāng)下火熱的腫瘤治療方法之一。與早期的基于T細(xì)胞的Adoptive cell transfer（ACT）不同，CAR-T技術(shù)融入B細(xì)胞，也就是抗體的識(shí)別能力。因此CAR-T能靶向MHC異常表達(dá)或不表達(dá)的腫瘤細(xì)胞，并能作用于多數(shù)傳統(tǒng)ACT無(wú)法靶向的細(xì)胞膜表面靶點(diǎn)[1]。

CAR-T原理圖，來(lái)源于參考資料[1]

隨著在B細(xì)胞血液腫瘤領(lǐng)域的巨大成功，CAR-T療法的臨床前研究和臨床試驗(yàn)發(fā)展迅速。目前，就臨床數(shù)目而言，CAR-T療法在腫瘤免疫領(lǐng)域僅次于基于免疫檢查點(diǎn)抑制劑的療法。中國(guó)和美國(guó)則是推動(dòng)CAR-T療法臨床轉(zhuǎn)化的主力軍[2]。相較于美國(guó)，接近八成的國(guó)內(nèi)研究已處于臨床階段。同時(shí)，對(duì)比2018年，我們可以看到國(guó)內(nèi)制藥企業(yè)對(duì)于CAR-T療法的布局和推動(dòng)[2]。

CAR-T治療臨床研究數(shù)目，來(lái)源于參考資料[2]

當(dāng)下，如何將CAR-T療法的成功復(fù)制至非B細(xì)胞血液腫瘤和實(shí)體瘤是該領(lǐng)域研究的關(guān)鍵點(diǎn)和重點(diǎn)。在實(shí)體瘤研究方向，體內(nèi)研究和臨床試驗(yàn)證明Therapeutic window的存在，并發(fā)現(xiàn)CAR-T細(xì)胞能清除靶點(diǎn)陰性的腫瘤細(xì)胞，為攻克實(shí)體瘤提供一絲曙光[2]。除了腫瘤領(lǐng)域，CAR-T研究已衍生至心臟損傷[3]，HIV[4]和自身免疫[5]等多個(gè)疾病領(lǐng)域，成為了非常有潛力的新興治療技術(shù)。

在此，結(jié)合一線的研究進(jìn)展，我們向大家介紹珀金埃爾默生命科學(xué)產(chǎn)品線針對(duì)CAR-T研究的應(yīng)用切入點(diǎn)，助力下一代CAR-T療法研發(fā)。

體外研究應(yīng)用：

針對(duì)CAR-T研究，珀金埃爾默主要圍繞體外和體內(nèi)兩個(gè)方向提供完善的解決方案。其中，針對(duì)體外研究，我們關(guān)注體外CAR-T細(xì)胞的活化、活力檢測(cè)和分析。與Cytotoxic T細(xì)胞活化類似，CAR-T細(xì)胞的活化通常伴隨著細(xì)胞因子的分泌、CAR-T細(xì)胞的增殖和后特異性靶向腫瘤細(xì)胞的殺傷 [6]。針對(duì)這三個(gè)過(guò)程，我們均提供對(duì)應(yīng)的基于放射/非放射平臺(tái)的金標(biāo)準(zhǔn)解決方案。在此，我們關(guān)注CAR-T細(xì)胞核心功能指標(biāo)：細(xì)胞殺傷的檢測(cè)。

1. 靈活應(yīng)用細(xì)胞殺傷解決方案

與傳統(tǒng)的基于化合物和抗體的直接細(xì)胞殺傷不同，基于CAR-T細(xì)胞的腫瘤殺傷是細(xì)胞-細(xì)胞相互作用的結(jié)果。因此，在分析殺傷中，檢測(cè)方法必須能夠特異區(qū)別靶細(xì)胞（腫瘤細(xì)胞）和效應(yīng)細(xì)胞（CAR-T細(xì)胞）。常見(jiàn)的細(xì)胞活力檢測(cè)法，如MTT、CCK-8和ATP法等，則不適于直接用于CAR-T介導(dǎo)的特異細(xì)胞殺傷檢測(cè)。針對(duì)區(qū)分的需求，我們提供兩大金標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)法：基于放射的51Cr釋放法和基于非放射的DELFIA® EuTDA細(xì)胞毒法[7]。兩種方法都基于利用探針、特異的標(biāo)記靶細(xì)胞。經(jīng)效應(yīng)細(xì)胞殺傷后，靶細(xì)胞出現(xiàn)裂解，并釋放探針到上清中用于定量殺傷效果。

⁵¹Cr釋放法檢測(cè)原理圖，圖片來(lái)源于參考資料[8]

除了支持特異檢測(cè)細(xì)胞殺傷外，51Cr釋放法和 DELFIA® EuTDA細(xì)胞毒法的另外一大優(yōu)勢(shì)就是靈活性，支持多種細(xì)胞系和原代細(xì)胞作為靶細(xì)胞或效應(yīng)細(xì)胞。例如，在近期的靶向CD19的CAR-T臨床研究中，科研人員通過(guò)標(biāo)記腫瘤細(xì)胞，利用⁵¹Cr釋放法證明低親和力的CAR-T 具有更強(qiáng)的細(xì)胞殺傷能力。而在后續(xù)的CAR-T無(wú)效的病人樣本研究中，基于同樣的檢測(cè)方法，科研人員通過(guò)標(biāo)記CAR-T細(xì)胞作為靶細(xì)胞，檢測(cè)病人針對(duì)CAR-T細(xì)胞是否具有免疫反應(yīng)（Anti-CAR反應(yīng)）[9]。

體外殺傷檢測(cè)結(jié)果。CAT為低親和力CAR-T，F(xiàn)MC83為常用CAR-T

基于病人臨床樣本的Anti-CAR檢測(cè)結(jié)果。圖片來(lái)源于參考資料[9]

通過(guò)改變靶細(xì)胞，我們提供的方法學(xué)還支持CAR-T療法的安全性分析，例如檢測(cè)On target, off tumor脫靶效應(yīng)帶來(lái)的細(xì)胞毒性[10]。此外，同種異體反應(yīng)也逐漸成為CAR-T療法安全性評(píng)價(jià)的一個(gè)重要考慮因素。針對(duì)此，我們提供DELFIA®BrdU 細(xì)胞增殖方法，通過(guò)混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)衡量CAR-T細(xì)胞的同種異體反應(yīng)[11]。

利用⁵¹Cr釋放法檢測(cè)脫靶效應(yīng)的細(xì)胞毒性，圖片來(lái)源于參考資料[10]；

基于DELFIA®BrdU 細(xì)胞增殖方法檢測(cè)CAR-T細(xì)胞的同種異體反應(yīng)，圖片來(lái)源于參考資料[11]

2. 深入成像技術(shù)應(yīng)用

相較于分子檢測(cè)，成像技術(shù)能提供二維到三維的靜止或動(dòng)態(tài)空間信息。因此基于成像的高通量篩選更具有選擇性，適合差異化篩選。例如，在2017年的臨床研究中，科研人員利用Opera Phenix高內(nèi)涵平臺(tái)，結(jié)合腫瘤細(xì)胞/正常細(xì)胞混合樣本進(jìn)行差異化篩選。利用成像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)，研究能發(fā)現(xiàn)只作用于腫瘤細(xì)胞、不影響正常細(xì)胞活力的藥物，提升了臨床用藥的安全性[12]。除了提升選擇性外，成像篩選還能支持幾小時(shí)到幾天的長(zhǎng)程篩選，因此可用于檢測(cè)免疫細(xì)胞的多輪殺傷能力[13]。

基于Opera Phenix 的高通量差異篩選流程圖，圖片來(lái)源于參考資料[12]

毫無(wú)疑問(wèn)，憑借其生理相關(guān)性和支持高通量篩選的優(yōu)勢(shì)，3D類器官和微組織球研究是當(dāng)下多個(gè)科研和制藥領(lǐng)域的熱門主題和方向，也是我們成像應(yīng)用的重要關(guān)注點(diǎn)。針對(duì)多種腫瘤，基于小分子藥物的研究已證實(shí)3D腫瘤組織樣本能有效預(yù)測(cè)藥物敏感度[14]。在CAR-T和細(xì)胞治療研究方向，3D水平研究也逐漸嶄露頭角。在近期的研究中，Opera Phenix高內(nèi)涵平臺(tái)被用于衡量、對(duì)比靶向Mesothelin的CAR-T細(xì)胞的殺傷能力 [15] 。除了3D水平研究外，活細(xì)胞動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)也會(huì)成為我們針對(duì)CAR-T研究的主要開(kāi)拓點(diǎn)。與干細(xì)胞類似，CAR-T細(xì)胞和免疫細(xì)胞在活化和行使功能過(guò)程中是代謝水平高度動(dòng)態(tài)的，并持續(xù)存在和癌細(xì)胞及其他免疫細(xì)胞的相互作用 [16]。因此，基于成像的動(dòng)態(tài)分析非常適合在體外深入解析CAR-T細(xì)胞的功能潛能。

利用Opera Phenix 檢測(cè)CAR-T細(xì)胞針對(duì)3D腫瘤樣本的殺傷能力，圖片來(lái)源于參考資料[15]

體內(nèi)研究應(yīng)用：

針對(duì)體內(nèi)研究，珀金埃爾默主要提供完善的活體成像解決方案，包括性能的IVIS系列和對(duì)應(yīng)的細(xì)胞株和熒光染料。作為主流的活體成像平臺(tái)，IVIS系列被廣泛用于臨床前CAR-T研究和突破實(shí)體瘤治療的多種瓶頸[1]。在此，我們主要介紹助力下一代CAR-T研發(fā)的兩大利器：腫瘤成像和免疫細(xì)胞成像。

1. 腫瘤活體成像：協(xié)助建立復(fù)雜的腫瘤模型

圍繞CAR-T臨床前研發(fā)，IVIS系列能協(xié)助建立多種常見(jiàn)的實(shí)體瘤和血液瘤模型，靈敏追蹤腫瘤的進(jìn)展和動(dòng)態(tài)評(píng)估CAR-T細(xì)胞的抗癌作用。在此基礎(chǔ)上，IVIS系列還可以和多種新興的技術(shù)聯(lián)用，協(xié)助建立復(fù)雜的腫瘤表型。例如，在靶向多發(fā)性骨髓瘤的CAR-T臨床治療中，一個(gè)常見(jiàn)的挑戰(zhàn)就是BCMA陰性腫瘤細(xì)胞的存在和出現(xiàn)。對(duì)此，研究結(jié)合Crispr技術(shù)，建立融合螢火蟲(chóng)報(bào)告基因的BCMA陰性腫瘤細(xì)胞，并將其混合BCMA陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞建立腫瘤模型?；铙w成像數(shù)據(jù)可以看出，BCMA CAR-T細(xì)胞無(wú)法作用于BCMA陰性腫瘤細(xì)胞，而靶向GPRC5D的CAR-T細(xì)胞能有效*BCMA陰性腫瘤細(xì)胞[17]。

結(jié)合Crispr技術(shù)的腫瘤模型建立和活體成像檢測(cè)，圖片來(lái)源于參考資料[17]

同樣基于Crispr技術(shù)，近期的研究利用活體成像平臺(tái)開(kāi)展和驗(yàn)證靶向CD8 T細(xì)胞的活體Crispr篩選，為靶向膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的免疫治療提供了新的靶點(diǎn)[18]。通過(guò)改變接種的流程和治療策略，IVIS系列還可以協(xié)助建立腫瘤復(fù)發(fā)、晚期腫瘤和病人來(lái)源移植腫瘤模型。

基于Crispr技術(shù)的體內(nèi)篩選驗(yàn)證流程，圖片來(lái)源于參考資料[18]

2. 免疫細(xì)胞活體成像：直觀展示體內(nèi)免疫細(xì)胞-腫瘤細(xì)胞相互作用

除了腫瘤細(xì)胞成像，我們還能通過(guò)標(biāo)記CAR-T細(xì)胞或其他免疫細(xì)胞進(jìn)行活體成像[17]。該應(yīng)用對(duì)于CAR-T和其他免疫療法的研究尤為重要。因?yàn)橥ㄟ^(guò)活體成像，我們能直觀的監(jiān)測(cè)、分析免疫細(xì)胞的體內(nèi)動(dòng)態(tài)分布和遷移等關(guān)鍵的信息。鑒于CAR-T細(xì)胞體內(nèi)的擴(kuò)增、遷移和腫瘤部位的殺傷功能是當(dāng)下CAR-T臨床應(yīng)用的主要限制因素[1]。這些信息的獲得對(duì)于新一代CAR-T研發(fā)至關(guān)重要。

在近期的一份研究中，科研人員展示了CAR-T細(xì)胞遷移能力對(duì)于殺傷效果的重要性[19]。利用腫瘤細(xì)胞，尤其是在輻射處理后，會(huì)過(guò)表達(dá)IL-18的特點(diǎn)，研究人員改造CAR-T細(xì)胞，使其過(guò)表達(dá)IL-18受體 CXCR-1或CXCR-2來(lái)提升體內(nèi)的遷移能力。結(jié)合帶有報(bào)告基因的CAR-T細(xì)胞和過(guò)表達(dá)遠(yuǎn)紅外蛋白iRFP720的腫瘤細(xì)胞，研究就能直觀追蹤和對(duì)比免疫細(xì)胞的分布變化和腫瘤的進(jìn)展情況，做到體內(nèi)水平的細(xì)胞細(xì)胞相互作用研究。相較于對(duì)照細(xì)胞，改造的CAR-T細(xì)胞具有更強(qiáng)的遷移能力和殺傷腫瘤能力。同時(shí)，在晚期腫瘤模型上，研究證實(shí)未改造CAR-T細(xì)胞主要分布于外周，不能有效靶向腫瘤部位[19]。

CAR-T體內(nèi)模型的CAR-T細(xì)胞成像（左，化學(xué)發(fā)光）和腫瘤細(xì)胞成像（中，熒光）；右圖為對(duì)應(yīng)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)，圖片基于參考資料[19]

進(jìn)一步結(jié)合免疫熒光技術(shù)，研究證實(shí)了由IVIS采集的化學(xué)發(fā)光信號(hào)能有效反映治療早期的CAR-T細(xì)胞浸潤(rùn)情況，是腫瘤微環(huán)境免疫細(xì)胞活體追蹤的有力手段。同時(shí)，治療早期的化學(xué)發(fā)光信號(hào)也能有效預(yù)測(cè)小鼠的生存時(shí)間，為CAR-T療效預(yù)測(cè)提供了新的切入點(diǎn)。后，同時(shí)結(jié)合腫瘤和CAR-T細(xì)胞活體成像，我們還能做到靶向CAR-T細(xì)胞功能水平的持續(xù)監(jiān)測(cè)。在腫瘤消退后，我們?cè)俅沃踩肽[瘤細(xì)胞，建立Re-challenge模型，通過(guò)活體成像直觀評(píng)價(jià)CAR-T細(xì)胞的長(zhǎng)期分布和功能[19]。

利用免疫熒光和活體成像技術(shù)追蹤治療早期CAR-T細(xì)胞的侵潤(rùn)情況；CD45指示CAR-T細(xì)胞，圖片來(lái)源于參考資料[19]

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7. 細(xì)胞治療干貨 | 免疫細(xì)胞殺傷經(jīng)典案例https://mp.weixin.qq.com/s/47krDPy-vsxSP91T1GDw

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19. Jin L, et al.CXCR1- or CXCR2-modified CAR T cells co-opt IL-8 for maximal antitumor efficacy in solid tumors. Nat Commun. 2019 Sep 5;10(1):4016.

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報(bào)告題目：從基因到表型組學(xué)的藥物研發(fā)一體化智能平臺(tái)

報(bào)告人：珀金埃爾默市場(chǎng)開(kāi)發(fā)主管 徐雍羽博士

報(bào)告時(shí)間：11月30日9:20-9:45

報(bào)告地點(diǎn)：細(xì)胞治療與基因治療分會(huì)場(chǎng)

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