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圖1. Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯(lián)將信號從細胞表面受體如EGF受體（EGFR）傳播到細胞內(nèi)蛋白質(zhì)。ERK是該途徑的終組分，并且在被生長因子（例如EGF（表皮生長因子））激活后，觸發(fā)下游效應(yīng)，如激酶或轉(zhuǎn)錄因子的激活。

該途徑被不同類型的受體激活，包括受體酪氨酸激酶 （例如EGF受體）以及G蛋白偶聯(lián)受體。作為信號傳導(dǎo)途徑的終組分，ERK磷酸化不同的細胞內(nèi)蛋白質(zhì)，包括大量其他激酶和轉(zhuǎn)錄因子。ERK信號傳導(dǎo)途徑存在于各種癌癥類型中，因此正在研究作為治療干預(yù)的靶標(biāo)。

在這里，我們描述了如何在Operetta CLS高內(nèi)涵分析系統(tǒng)上自動化研究ERK信號傳導(dǎo)的活細胞FRET測定。該測定可以用于藥物發(fā)現(xiàn)。

基于FRET的ERK生物傳感器

FRET是從供體分子到受體分子的非輻射能量轉(zhuǎn)移。能量轉(zhuǎn)移需要供體和受體間隔小于10nm，因此提供了研究分子接近度變化的敏感工具，例如蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用（分子間FRET）或蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化（分子內(nèi)FRET）。在這項研究中，我們專注于分子內(nèi)FRET，使用稱為EKAREV的CFP-YFP生物傳感器（圖2）。穩(wěn)定表達EKAREV的細胞由Somponnat Sampattavanich博士友情提供（圖3）。在該生物傳感器中，供體和受體熒光團以單一融合蛋白編碼。EKAREV生物傳感器經(jīng)過優(yōu)化，可以減少隨機觸發(fā)的基礎(chǔ)FRET信號，并使其可靠地與距離相關(guān)。ERK對EKAREV的磷酸化觸發(fā)構(gòu)象變化，使CFP和YFP靠近誘導(dǎo)FRET。

圖2.細胞外信號調(diào)節(jié)激酶活性報告基因（EKAREV）的示意圖。在該生物傳感器中，兩種熒光蛋白通過ERK底物結(jié)構(gòu)域，接頭和結(jié)合結(jié)構(gòu)域分開。一旦ERK底物結(jié)構(gòu)域經(jīng)過ERK的磷酸化，就會觸發(fā)構(gòu)象變化，使CFP和YFP緊密接近并允許FRET發(fā)生。

EKAREV生物傳感器是分子內(nèi)FRET的實例，其中供體和受體以1：1的固定化學(xué)計量存在。因此，進行雙通道比率實驗就足夠了，通道1檢測受體發(fā)射光(

I_Acceptor)，通道2檢測供體發(fā)射光(I_Donor)，將得到的兩個熒光信號強度進行背景校正，并計算它們的比率以給出相對FRET效率E_FRET:

測定方法

將1.2×10₄EKAREV細胞/孔接種到CellCarrier-96Ultra微量培養(yǎng)板（PerkinElmer＃6055300），150μl培養(yǎng)基（表1）中。孵育2天后（37℃，5％CO₂），150μl饑餓培養(yǎng)基洗滌兩次并在饑餓培養(yǎng)基中孵育5小時以降低基礎(chǔ)ERK活性。另外，在孵育開始時向細胞中加入各種濃度的抑制劑或DMSO。4.5小時后，將細胞核用4μM DRAQ5在37℃，5％CO₂下染色30分鐘。然后用饑餓培養(yǎng)基洗滌細胞一次，并加入含有8μl 20x濃縮抑制劑或DMSO對照的150μl新鮮饑餓培養(yǎng)基。作為對照，在某一時間點，向細胞中加入8μl20x濃縮誘導(dǎo)物（PMA或EGF）。為了抑制FRET信號，應(yīng)用PD184352，SCH772984和Ulixertinib。含有或不含有所測試化合物的DMSO濃度的培養(yǎng)基用作對照。

試劑，化合物和介質(zhì)列表

成像

在寬場模式下使用20x高NA物鏡（NA 0.8）在Operetta CLS系統(tǒng)上建立長時間實驗，獲取圖像總共97分鐘。將FRET誘導(dǎo)化合物添加到血清饑餓細胞后，開始時間序列，測量間隔為每8分鐘一次，在此設(shè)置中獲得了四個渠道：DRAQ5 （ex 615-645，em655-760），CFP（ex 435-460，em 470-515），YFP（ex490-515，em 525-580）和FRET（ex 435-460，em 515-580）（圖3）。

圖

分析策略

使用Harmony®高內(nèi)涵成像和分析軟件進行自動圖像分析。簡言之，將圖像分割成細胞和背景。計算細胞質(zhì)和背景中的供體和FRET強度，然后計算背景校正的FRET比率作為終結(jié)果（圖4）。

圖4.使用Harmony軟件進行比率FRET定量的圖像分析工作流程：細胞和背景的細胞質(zhì)被分段，低表達細胞被強度閾值排除。量化供體和FRET通道的強度及其適當(dāng)?shù)谋尘埃⒂嬎惚尘靶Ｕ腇RET強度比。減去背景強度在活細胞應(yīng)用中尤其有利，其中具有自發(fā)熒光組分的培養(yǎng)基通常導(dǎo)致更高的背景并因此導(dǎo)致更小的測定窗口。

結(jié)果

為了探索是否可以使用基于FRET的生物傳感器在Operetta CLS上研究ERK信號傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)，用不同的ERK和MEK激活劑和抑制劑處理EKAREV細胞。（圖5）。

圖5.外源添加的活化劑（綠色）和抑制劑（紅色）示意圖及其對ERK信號通路的影響。表達EKAREV的細胞用EGF或PMA處理以誘導(dǎo)ERK活化，另外，用三種MEK和ERK特異性抑制劑（PD184352，SCH772984，Ulixertinib），在途徑的不同位置中斷信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

PMA和EGF充當(dāng)Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯(lián)的特異性激活劑。EGF特異性結(jié)合細胞表面上的EGF受體，而PMA作為親脂性，膜可滲透的分子通過直接激活RAF激活該途徑。PD184352可以通過選擇性抑制MEK1/2來抑制ERK途徑，而Ulixertinib和SCH772984都是ERK1/2的有效和選擇性抑制劑。

首先，為了更多地了解FRET誘導(dǎo)和抑制的動態(tài)性質(zhì)，記錄了97分鐘的長時實驗。正如所料，與未處理的對照相比，單獨用EGF或PMA處理細胞導(dǎo)致FRET比率的強烈增加（圖6）。大約30分鐘后信號處于高位。對照顯示較低水平的ERK活化，并且觀察到隨時間穩(wěn)定增加。由于ERK1/2可以通過多種生長因子和有絲分裂來調(diào)節(jié)，這可能是由活細胞成像過程中的自分泌或旁分泌信號引起的。用不同濃度的ERK抑制劑（SCH772984）共同處理細胞導(dǎo)致ERK反應(yīng)的劑量依賴性降低。在5μMSCH772984中，通過EGF的ERK活化幾乎可以忽略不計，表明在該濃度下ERK被*抑制。請注意，0.5％DMSO是實驗中使用的濃度，確實對FRET比率有影響，因此需要包括此對照。用第二種ERK1/2特異性抑制劑Ulixertinib獲得了類似的結(jié)果（數(shù)據(jù)未顯示）。

圖6.在Operetta CLS系統(tǒng)上使用基于EKAREV FRET的生物傳感器的ERK信號傳導(dǎo)的時間進程。通過EGF或PMA刺激ERK誘導(dǎo)快速FRET信號增加，在約30分鐘后平穩(wěn)。高濃度的SCH772984（5μM）導(dǎo)致幾乎*抑制ERK活化（1μg/ ml EGF），沒有可測量的FRET信號增加。較高稀釋度的SCH772984僅部分抑制EGF誘導(dǎo)的ERK活化。control顯示沒有任何處理的樣品有中間輕微上升的FRET信號。0.5％DMSO略微抑制FRET信號，這是實驗中使用的DMSO的濃度。測定統(tǒng)計：Z'= 0.87（在時間點32分鐘計算，DMSO為陰性，EGF為陽性對照）

當(dāng)FRET信號在32分鐘后達到恒定水平時，選擇該時間點以確定SCH772984的IC50值。用1μg/ mL EGF和系列稀釋的SCH772984處理EKAREV細胞，稀釋范圍為10pM至3μM。計算的IC50值為272nM的劑量反應(yīng)曲線如圖7所示。

圖7.ERK抑制劑SCH772984導(dǎo)致基于FRET的EKAREV信號的劑量依賴性降低。在1μg/ ml EGF存在下，用遞增濃度的SCH772984處理EKAREV細胞。在孵育32分鐘后，在Operetta CLS系統(tǒng)上測定FRET比率，因為信號在此時間點穩(wěn)定。高Z'值（Z'= 0.89）顯示出優(yōu)異的分析性能。

為了研究EKAREV FRET成像測定是否可用于研究直接作用于MEK1/2的途徑調(diào)節(jié)，測試了MEK1/2抑制劑PD184352對PMA化細胞的作用（圖8）。如圖所示，PD184352抑制PMA誘導(dǎo)的ERK活化。

圖8.在Operetta CLS系統(tǒng)上測量的PD184352對PMA活化的Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯(lián)的抑制。EKAREV細胞用另一組活化劑和抑制劑（PMA+PD184352）處理，其作用在RAF/MEK的上游（與圖5比較）。用200或2000nM PMA處理的EKAREV細胞顯示出高FRET反應(yīng)（誘導(dǎo)后32分鐘）。通過將細胞與MEK1/2特異性抑制劑PD184352以10μM的濃度共孵育來抑制活化。

結(jié)論

EKAREV FRET生物傳感器可用于Operetta CLS系統(tǒng)的活細胞成像測定，以研究ERK的激活和抑制。級聯(lián)內(nèi)不同靶標(biāo)的調(diào)節(jié)很容易測量，因此這種方法可以有助于鑒定干擾Ras/Raf/MEK/ERK信號級聯(lián)的新化合物。該測定在活細胞中進行，因此它可用于分析ERK信號傳導(dǎo)動力學(xué)，而定量ERK磷酸化的常規(guī)生物化學(xué)技術(shù)通常是終點測定。盡管細胞群中生物傳感器表達水平相對不均勻（圖3），但FRET比率的計算提供了特別好的化驗數(shù)據(jù)和統(tǒng)計數(shù)據(jù)，Z'值高于0.87。

EKAREV生物傳感器的優(yōu)化設(shè)計，Operetta CLS系統(tǒng)的高質(zhì)量成像以及Harmony內(nèi)圖像分析的出色工具都有助于提高這里提供的高含量FRET分析的穩(wěn)定性。Harmony軟件的構(gòu)建模塊概念允許創(chuàng)建易于設(shè)置和理解的圖像分析序列，并且不需要專業(yè)的圖像分析知識。該測定還提供了Opera Phenix™高含量篩選系統(tǒng)的可比較結(jié)果和測定統(tǒng)計數(shù)據(jù)。由于Operetta CLS和Opera Phenix系統(tǒng)比傳統(tǒng)顯微鏡具有更高的通量，基于FRET的生物傳感器的高含量成像為藥物發(fā)現(xiàn)和細胞信號傳導(dǎo)中的基礎(chǔ)研究開辟了新的可能性。

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