實(shí)時熒光定量PCR：
實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點(diǎn)檢測的局限，實(shí)現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強(qiáng)度，并記錄在電腦軟件之中，通過對每個樣品Ct值的計算，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線獲得定量結(jié)果。因此，實(shí)時熒光定量PCR無需內(nèi)標(biāo)是建立在兩個基礎(chǔ)之上的：
1）Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達(dá)Ct值所在的循環(huán)數(shù)時，剛剛進(jìn)入真正的指數(shù)擴(kuò)增期（對數(shù)期），此時微小誤差尚未放大，因此Ct值的重現(xiàn)性，即同一模板不同時間擴(kuò)增或同一時間不同管內(nèi)擴(kuò)增，得到的Ct值是恒定的。
2）Ct值與起始模板的線性關(guān)系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關(guān)系，可利用標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知樣品進(jìn)行定量測定，因此，實(shí)時熒光定量PCR是一種采用外標(biāo)準(zhǔn)曲線定量的方法。
外標(biāo)準(zhǔn)曲線的定量方法相比內(nèi)標(biāo)法是一種準(zhǔn)確的、值得信賴的科學(xué)方法。利用外標(biāo)準(zhǔn)曲線的實(shí)時熒光定量PCR是迄今為止定量最準(zhǔn)確，重現(xiàn)性*定量方法，已得到的*，廣泛用于基因表達(dá)研究、轉(zhuǎn)基因研究，藥物療效考核、病原體檢測等諸多領(lǐng)域。
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參數(shù)規(guī)格：
產(chǎn)品名稱：肺炎支原體和肺炎衣原體核酸檢測試劑盒
產(chǎn)品規(guī)格：50T
產(chǎn)品貨號：FS-P9739
產(chǎn)品分類：熒光PCR法
產(chǎn)品運(yùn)輸：低溫運(yùn)輸
儲存條件：-20℃避光保存，避免反復(fù)凍融。
運(yùn)輸：低溫、避光，快遞免費(fèi)送貨上門。
產(chǎn)品特點(diǎn)：
本產(chǎn)品就是根據(jù)保守區(qū)設(shè)計引物而開發(fā)的高靈敏 PCR檢測試劑盒 。
實(shí)驗(yàn)過程：
一、試劑準(zhǔn)備
1. DNA模板
2．對應(yīng)目的基因的特異引物（在PCR反應(yīng)中，新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復(fù)制，而不能從無到有，憑空合成。這一小段序列就是你所要有設(shè)計的引物?？梢允荄NA也可以是RNA，一般20多bp，需要根據(jù)你的模板鏈設(shè)計。因此，擴(kuò)增不同的基因需要設(shè)計不同的引物）
3．10×PCR Buffer
4．2mM dNTPmix：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5．Taq酶
二、操作步驟 
1．在冰浴中，按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer             5μl
dNTP mixl                 4μl
引物1（10pM）               2μl
引物2（10PM）              2μl
Taq酶（2U/μl）            1μl
DNA模板（50ng-1μg/μl）    1 μl
加ddH2O至               50 μl
視PCR儀有無熱蓋，不加或添加石蠟油。
2．調(diào)整好反應(yīng)程序。將上述混合液稍加離心，立即置PCR儀上，執(zhí)行擴(kuò)增。一般：在93℃預(yù)變性3-5min，進(jìn)入循環(huán)擴(kuò)增階段：93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s，循環(huán)30-35次，zui后在72℃ 保溫7min。
3．結(jié)束反應(yīng)，PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4．PCR的電泳檢測：如在反應(yīng)管中加有石蠟油，需用100μlLuFang進(jìn)行抽提反應(yīng)混合液，以除去石蠟油；否則，直接取5-10μl電泳檢測。
定量PCR方法：
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點(diǎn)的外源競爭性模板。在同一反應(yīng)管中，待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴(kuò)增（其中一個引物為熒光標(biāo)記）。擴(kuò)增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物，競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段，而待測模板不被酶切，可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開，分別測定熒光強(qiáng)度，根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應(yīng)管中加入已定量的內(nèi)標(biāo)和引物，內(nèi)標(biāo)用基因工程方法合成。上游引物用熒光標(biāo)記，下游引物不標(biāo)記。在模板擴(kuò)增的同時，內(nèi)標(biāo)也被擴(kuò)增。在PCR產(chǎn)物中，由于內(nèi)標(biāo)與靶模板的長度不同，二者的擴(kuò)增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來，分別測定其熒光強(qiáng)度，以內(nèi)標(biāo)為對照定量待檢測模板。
c、PCR－ELISA法
利用di高辛或生物素等標(biāo)記引物，擴(kuò)增產(chǎn)物被固相板上特異的探針?biāo)Y(jié)合，再加入抗di高辛或生物素酶標(biāo)抗體－辣根過氧化物酶結(jié)合物，最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR－ELISA法只是定性實(shí)驗(yàn)，若加入內(nèi)標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，也可實(shí)現(xiàn)定量檢測目的。
PCR的反應(yīng)條件：
因擴(kuò)增片段的大小、反應(yīng)體積、使用擴(kuò)增儀器的不同而不同。
◇ 循環(huán)次數(shù)
根據(jù)模板DNA的量以及擴(kuò)增片段的大小，設(shè)定25～30個循環(huán)。
如果循環(huán)次數(shù)太少，擴(kuò)增量不足；如果循環(huán)次數(shù)太多，則會出現(xiàn)Smear。
◇ Anneal以及Extension
合適的Anneal溫度通常在45～68℃之間 (預(yù)備實(shí)驗(yàn)可2℃間隔進(jìn)行)。另外，由于在60～68℃間，也有很高的活性, 因此可在此溫度范圍內(nèi)設(shè)定Anneal-Extension溫度, 進(jìn)行2 Step PCR。Anneal-Extension溫度為68℃ 時，每kbp大體可設(shè)定30秒～1分鐘；當(dāng)溫度設(shè)定在68℃以下時, 時間設(shè)定可稍長一些。通常，Anneal溫度太高，有時會得不到擴(kuò)增產(chǎn)物；Anneal溫度太低時，容易發(fā)生非特異性反應(yīng)。另外，Extension時間太短時，會得不到擴(kuò)增產(chǎn)物或者會有一些短的非特異性產(chǎn)物優(yōu)成；而Extension時間太長時，會出現(xiàn)Smear。
人導(dǎo)管癌；MDA-MB-134Ⅵ形態(tài)特性: 上皮樣生長特性: 松散貼壁生長Anti-HMGB1 Polyclonal Antibody

人肺腺癌；NCI-H2009形態(tài)特性: 上皮樣生長特性: 貼壁生長Anti-Phospho-H2AFX-S139 Polyclonal Antibody

豬腎；PK(15)形態(tài)特性: 上皮樣生長特性: 貼壁生長Anti-PGC Polyclonal Antibody

大鼠胰島β瘤；RIN-m5F形態(tài)特性: 上皮樣生長特性: 貼壁生長Anti-CBX3 Polyclonal Antibody

小鼠骨髓瘤；P3/NSI/1-Ag4-1形態(tài)特性: 淋巴母樣生長特性: 懸浮生長Anti-Cyclin B1 Polyclonal Antibody

雜交瘤（B類）；Z51B3C10H12A12G2F7E7形態(tài)特性: 淋巴母樣生長特性: 懸浮生長Anti-MOCS3 Polyclonal Antibody

SV-40轉(zhuǎn)化肺成纖維；WI38/VA13形態(tài)特性: 上皮樣生長特性: 貼壁生長Anti-BAG2 Polyclonal Antibody

小鼠B雜交瘤；W6/32形態(tài)特性: 淋巴母樣生長特性: 懸浮生長Anti-LDHA Polyclonal Antibody

人肺腺癌；SPC-A1形態(tài)特性: 上皮樣生長特性: 貼壁生長Anti-ACTG1 Polyclonal Antibody

人滑膜肉瘤；SW982形態(tài)特性: 多角生長特性: 貼壁生長Anti-KRT10 Polyclonal Antibody

非洲綠猴腎；VeroE6形態(tài)特性: 上皮樣生長特性: 貼壁生長Anti-PAX2 Polyclonal Antibody

雜交瘤（B類）；Z51B3C10H12A12G2F7B5形態(tài)特性: 淋巴母樣生長特性: 懸浮生長Anti-RRAGD Polyclonal Antibody

人結(jié)直腸腺癌；NCI-H716形態(tài)特性: 上皮樣生長特性: 懸浮生長，聚團(tuán)，少數(shù)貼壁Anti-NR3C1 Polyclonal Antibody

人T淋巴白血?。籋uT78形態(tài)特性: 淋巴母樣；圓形生長特性: 懸浮生長Anti-PEG3 Polyclonal Antibody

人癌；ZR-75-30[ZR7530]形態(tài)特性: 上皮樣；多角生長特性: 貼壁生長Anti-ANPEP Polyclonal Antibody

人結(jié)直腸腺癌；SK-CO-1形態(tài)特性: 上皮樣生長特性: 貼壁生長Anti-KCTD17 Polyclonal Antibody
肺炎支原體和肺炎衣原體核酸檢測試劑盒大鼠血紅素氧合酶2(HO-2)ELISA試劑盒Cyclin-D1ELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

大鼠分泌型免疫球蛋白A(sIgA)ELISA試劑盒Cyclin-D2ELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

大鼠蛋白激酶B(PKB)ELISA試劑盒Cyclin-D3ELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

大鼠磷肌醇3激酶(PI3K)ELISA試劑盒CYFRA21-1ELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

大鼠心肌肌鈣蛋白Ⅰ(cTn-Ⅰ)ELISA試劑盒CYP21AELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

大鼠凝血酶受體(TR)ELISA試劑盒CYP21BELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

大鼠抗凝血酶受體(ATR)ELISA試劑盒CYP2E1ELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。

大鼠凝血酶抗凝血酶復(fù)合物(TAT)ELISA試劑盒CYP450ELISAKit產(chǎn)品規(guī)格:48T/96T。