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實時熒光定量PCR:
實時熒光定量PCR技術有效地解決了傳統(tǒng)定量只能終點檢測的局限,實現(xiàn)了每一輪循環(huán)均檢測一次熒光信號的強度,并記錄在電腦軟件之中,通過對每個樣品Ct值的計算,根據(jù)標準曲線獲得定量結果。因此,實時熒光定量PCR無需內(nèi)標是建立在兩個基礎之上的:
1)Ct值的重現(xiàn)性PCR循環(huán)在到達Ct值所在的循環(huán)數(shù)時,剛剛進入真正的指數(shù)擴增期(對數(shù)期),此時微小誤差尚未放大,因此Ct值的重現(xiàn)性,即同一模板不同時間擴增或同一時間不同管內(nèi)擴增,得到的Ct值是恒定的。
2)Ct值與起始模板的線性關系由于Ct值與起始模板的對數(shù)存在線性關系,可利用標準曲線對未知樣品進行定量測定,因此,實時熒光定量PCR是一種采用外標準曲線定量的方法。
外標準曲線的定量方法相比內(nèi)標法是一種準確的、值得信賴的科學方法。利用外標準曲線的實時熒光定量PCR是迄今為止定量最準確,重現(xiàn)性*定量方法,已得到的*,廣泛用于基因表達研究、轉(zhuǎn)基因研究,藥物療效考核、病原體檢測等諸多領域。
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參數(shù)規(guī)格:
產(chǎn)品名稱:轉(zhuǎn)基因植物NOS終止子核酸檢測試劑盒
產(chǎn)品規(guī)格:50T
產(chǎn)品貨號:FS-P10534
產(chǎn)品分類:熒光PCR法
產(chǎn)品運輸:低溫運輸
儲存條件:-20℃避光保存,避免反復凍融。
運輸:低溫、避光,快遞免費送貨上門。
產(chǎn)品特點:
本產(chǎn)品就是根據(jù)保守區(qū)設計引物而開發(fā)的高靈敏 PCR檢測試劑盒 。
實驗過程:
一、試劑準備
1. DNA模板
2.對應目的基因的特異引物(在PCR反應中,新合成的DNA是要接在一小段序列上才能繼續(xù)按照模板DNA復制,而不能從無到有,憑空合成。這一小段序列就是你所要有設計的引物??梢允荄NA也可以是RNA,一般20多bp,需要根據(jù)你的模板鏈設計。因此,擴增不同的基因需要設計不同的引物)
3.10×PCR Buffer
4.2mM dNTPmix:含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM
5.Taq酶
二、操作步驟
1.在冰浴中,按以下次序?qū)⒏鞒煞旨尤胍粺o菌0.5ml離心管中。
10×PCR buffer 5μl
dNTP mixl 4μl
引物1(10pM) 2μl
引物2(10PM) 2μl
Taq酶(2U/μl) 1μl
DNA模板(50ng-1μg/μl) 1 μl
加ddH2O至 50 μl
視PCR儀有無熱蓋,不加或添加石蠟油。
2.調(diào)整好反應程序。將上述混合液稍加離心,立即置PCR儀上,執(zhí)行擴增。一般:在93℃預變性3-5min,進入循環(huán)擴增階段:93℃ 40s → 58℃ 30s → 72℃ 60s,循環(huán)30-35次,zui后在72℃ 保溫7min。
3.結束反應,PCR產(chǎn)物放置于4℃待電泳檢測或-20℃長期保存。
4.PCR的電泳檢測:如在反應管中加有石蠟油,需用100μlLuFang進行抽提反應混合液,以除去石蠟油;否則,直接取5-10μl電泳檢測。
定量PCR方法:
a、競爭法
選擇由突變克隆產(chǎn)生的含有一個新內(nèi)切位點的外源競爭性模板。在同一反應管中,待測樣品與競爭模板用同一對引物同時擴增(其中一個引物為熒光標記)。擴增后用內(nèi)切酶消化PCR產(chǎn)物,競爭性模板的產(chǎn)物被酶解為兩個片段,而待測模板不被酶切,可通過電泳或高效液相將兩種產(chǎn)物分開,分別測定熒光強度,根據(jù)已知模板推測未知模板的起始拷貝數(shù)。
b、內(nèi)參照法
在不同的PCR反應管中加入已定量的內(nèi)標和引物,內(nèi)標用基因工程方法合成。上游引物用熒光標記,下游引物不標記。在模板擴增的同時,內(nèi)標也被擴增。在PCR產(chǎn)物中,由于內(nèi)標與靶模板的長度不同,二者的擴增產(chǎn)物可用電泳或高效液相分離開來,分別測定其熒光強度,以內(nèi)標為對照定量待檢測模板。
c、PCR-ELISA法
利用di高辛或生物素等標記引物,擴增產(chǎn)物被固相板上特異的探針所結合,再加入抗di高辛或生物素酶標抗體-辣根過氧化物酶結合物,最終酶使底物顯色。常規(guī)的PCR-ELISA法只是定性實驗,若加入內(nèi)標,作出標準曲線,也可實現(xiàn)定量檢測目的。
PCR的反應條件:
因擴增片段的大小、反應體積、使用擴增儀器的不同而不同。
◇ 循環(huán)次數(shù)
根據(jù)模板DNA的量以及擴增片段的大小,設定25~30個循環(huán)。
如果循環(huán)次數(shù)太少,擴增量不足;如果循環(huán)次數(shù)太多,則會出現(xiàn)Smear。
◇ Anneal以及Extension
合適的Anneal溫度通常在45~68℃之間 (預備實驗可2℃間隔進行)。另外,由于在60~68℃間,也有很高的活性, 因此可在此溫度范圍內(nèi)設定Anneal-Extension溫度, 進行2 Step PCR。Anneal-Extension溫度為68℃ 時,每kbp大體可設定30秒~1分鐘;當溫度設定在68℃以下時, 時間設定可稍長一些。通常,Anneal溫度太高,有時會得不到擴增產(chǎn)物;Anneal溫度太低時,容易發(fā)生非特異性反應。另外,Extension時間太短時,會得不到擴增產(chǎn)物或者會有一些短的非特異性產(chǎn)物優(yōu)成;而Extension時間太長時,會出現(xiàn)Smear。
-845℃冰箱凍結;真空冷凍干燥
白林蘑菇生長條件: 25-28℃培養(yǎng)基: 14提供形式: 斜面培養(yǎng)物安全等級: 1模式菌株: no -80℃冰箱凍結法;礦物油法;定期移植法
樺革裥菌培養(yǎng)基: 14模式菌株: no菌蓋或菌柄提供形式: 斜面培養(yǎng)物安全等級: 1生長條件: 26 定期移植法
3.010模式菌株: no安全等級: 1種屬: Neurospora│sp.玉米棒提供形式: 凍干物培養(yǎng)基: 0014生長條件: 25-28℃
大腸埃希氏菌生長條件: 37℃培養(yǎng)基: 33提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no 真空冷凍干燥法
致病性大腸埃希菌生長條件: 37℃培養(yǎng)基: CM0051提供形式: 凍干物安全等級: 2模式菌株: no 真空冷凍干燥法
枯草芽孢桿菌生長條件: 32℃培養(yǎng)基: 33胡楊樹葉提供形式: 凍干物模式菌株: no -80℃冰箱凍結法;真空冷凍干燥法
-846℃冰箱凍結;真空冷凍干燥
康寧木霉培養(yǎng)基: 14模式菌株: no腐木提供形式: 斜面培養(yǎng)物安全等級: 1生長條件: 25 定期移植法
玫瑰橙鏈霉菌培養(yǎng)基: 0012模式菌株提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: yes生長條件: 28℃ 液氮超低溫凍結法;真空冷凍干燥法
鏈霉菌培養(yǎng)基: 0012模式菌株: no土壤提供形式: 凍干物安全等級: 1生長條件: 28℃ 液氮超低溫凍結法;真空冷凍干燥法
芽孢桿菌生長條件: 28℃培養(yǎng)基: 0033提供形式: 凍干物安全等級: 1模式菌株: no -80℃冰箱凍結法;真空冷凍干燥法
谷氨棒桿菌培養(yǎng)基: 2模式菌株: no土壤提供形式: 凍干物安全等級: 1生長條件: 28℃ -80℃冰箱凍結法;真空冷凍干燥法
兔出血癥病研究模式菌株: no病兔提供形式: 凍干物安全等級: 3培養(yǎng)基: 0生長條件: 37
-847℃冰箱凍結;真空冷凍干燥
溶藻弧菌 -80℃冰箱凍結法;真空冷凍干燥法生長條件: 22℃提供形式: 凍干物;凍結物模式菌株: no培養(yǎng)基: 820
7-溴-1H-吲唑 2,4-二-5-硝基嘧啶 4,7,13,16,21-五氧雜-1,10-二氮雜二環(huán)[8.8.5]廿三烷
3-甲基-N-氧化物 N-乙基 2,2'-氧代雙乙胺
1-乙基環(huán)戊醇 2-環(huán)戊烯 1-乙?;?5-溴-4-吲哚-3-乙酯
N-[4-基-3-(基)基]甲基環(huán)氧丙烯酰胺 磺鋰 2-辛基十二醇
2-Methyl-2-butene 異戊烯 513-35-9
3-Bromoanisole 間溴甲醚 2398-37-0
3-TERT-BUTYL-4-HYDROXYANISOLE 3-叔丁基-4-羥基甲醚 121-00-6
4-Penten-1-ol 4-戊烯-1-醇 821-09-0
大鼠粘蛋白3(MUC3)ELISA 試劑盒 96T/48T 試劑盒 組裝/原裝
人血管緊張素Ⅰ受體抗體(ANG-ⅠR)免疫試劑盒 Human angiotension I receptor Aibody,ANG-ⅠR aibody ELISA Kit
人抗Sa抗體(ai-Sa-Ab)ELISA試劑盒 ,英文名: ai-Sa-Ab ELISA Kit
RatLeptieceptor,LR/Ob-RELISA試劑盒大鼠苗條素受體(LR/Ob-R)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
HumanGlypican-3,GPC-3ELISA試劑盒人磷脂酰肌醇蛋白聚糖3(GPC-3)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
Humankillercelllectin-likereceptor,KLRELISAKit人殺傷凝集素樣受體(KLR)ELISA試劑盒規(guī)格:96T/48T
轉(zhuǎn)基因植物NOS終止子核酸檢測試劑盒棗仁皂苷A55466-04-1中文別名:棗仁皂甙A
英文名:Jujuboside A
登錄號:55466-04-1
分子式:C58H94O26
分子量:1207.35
分子結構:
外觀:白色粉末
規(guī)格:20mg/支
純度:≥ 98%
用途:用于含量測定/鑒定/藥理實驗等。
提取來源:鼠李科植物棗的種子,又名棗仁、棗核。
熔點:222-225℃
藥理藥效:有抗心律失常作用。
貯存條件: 4℃冷藏、密封、避光
有效期: 2年
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