【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】近日，大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)研究部分子探針與熒光成像研究組(1818組)徐兆超研究員、喬慶龍副研究員團隊發(fā)展了一種“靶控自閃爍”熒光探針，并將其命名為“Blinkogenic Probe”，這類探針只有在識別靶標(biāo)后才會激活自閃爍熒光開關(guān)性能，排除了非靶向單分子定位的干擾，提升了單分子超分辨成像的定位準(zhǔn)確性，實現(xiàn)了活細胞內(nèi)免洗動態(tài)單分子超分辨成像。
 

　　單分子定位顯微鏡(SMLM)作為重要超分辨成像技術(shù)之一，能夠在單分子分辨率下，可視化生物分子的分布、分子間的相互作用、納米尺度的細胞器結(jié)構(gòu)、單個分子的催化反應(yīng)等。其突破納米成像極限的核心在于熒光開關(guān)分子在熒光“亮”態(tài)(ON)和“暗”態(tài)(OFF)之間轉(zhuǎn)換的能力，以保證單個分子的熒光信號在不同時間點被區(qū)分，并進行精確定位。傳統(tǒng)的發(fā)光調(diào)控策略，例如紫外光激活、高濃度外源性親核試劑或氧化還原調(diào)節(jié)劑、探針與靶點結(jié)合解離等，雖能獲取稀疏的熒光閃爍信號，卻因生物兼容性問題難以在活細胞內(nèi)實現(xiàn)原位、動態(tài)的超分辨成像，同時，由于缺乏準(zhǔn)確的靶點識別能力，SMLM成像技術(shù)受到單分子定位時的錯誤信號干擾。
 

　　1818組在前期工作中基于自閃爍熒光探針建立了羅丹明開關(guān)分子吉布斯自由能的差值(ΔGC-O)與開環(huán)比例的線性關(guān)系(R2=0.965)，設(shè)計了特定開環(huán)比例的羅丹明開關(guān)分子，以此高效地開發(fā)出了多顏色自閃爍熒光探針，并將其用于活細胞內(nèi)的動態(tài)單分子定位超分辨成像(Angew. Chem. Int. Ed，2020)。盡管自閃爍熒光探針在超分辨成像中展現(xiàn)出重要應(yīng)用潛力，其仍面臨著成像背景高等挑戰(zhàn)。例如，由于細胞內(nèi)存在未反應(yīng)或非特異性結(jié)合的自閃爍探針，這些探針同樣會表現(xiàn)出自發(fā)閃爍特性，會產(chǎn)生強烈的背景信號并嚴重干擾目標(biāo)分子的定位，降低了成像的定位準(zhǔn)確度。而隨著分辨率的不斷提高，尤其是當(dāng)接近1nm時，背景信號的問題將變得更加突出，成為制約超分辨成像技術(shù)進一步發(fā)展的關(guān)鍵因素。
 

　　本工作中，團隊發(fā)展的Blinkogenic Probe，可在與靶標(biāo)結(jié)合前保持“沉默”狀態(tài)，即不產(chǎn)生閃爍；而一旦與靶標(biāo)結(jié)合，其自閃爍性能立即被激活，從而實現(xiàn)精確的單分子定位，有效避免了非特異性標(biāo)記產(chǎn)生的閃爍背景。為了量化這一特性，團隊引入了新的參數(shù)“RDC”，定義為自閃爍激活前后的占空比比值，其中占空比為熒光探針在一定時間內(nèi)的熒光“亮”態(tài)占比。當(dāng)RDC值大于1時，表明熒光探針在識別靶標(biāo)后發(fā)生了自閃爍激活現(xiàn)象。本工作報道的HM-DS655-Halo的pKcycl為4.5以下，在生理條件下(pH=7.4)能夠保持自閃爍“沉默”狀態(tài)，而與HaloTag結(jié)合后，其兩性離子結(jié)構(gòu)被進一步穩(wěn)定，從而激活了自發(fā)閃爍。該探針的RDC值達到12，證明了識別HaloTag蛋白能夠高效激活探針的自閃爍性能，并在SMLM成像中有效消除了閃爍背景的干擾。利用這一探針，團隊實現(xiàn)了細胞內(nèi)動態(tài)的SMLM成像，包括線粒體分裂和接觸、細胞遷移和偽足生長等過程。此外，團隊利用該探針能夠精確追蹤活細胞中的各種偽足結(jié)構(gòu)，如絲狀偽足、片狀偽足和隧道納米管(TNT)，并揭示了絲狀偽足和片狀偽足之間的兩種不同融合模式，以及TNT的形成及其與絲狀偽足的相互作用。這些發(fā)現(xiàn)充分證明了Blinkogenic Probe自閃爍超分辨熒光探針在納米尺度上可視化實時偽足動態(tài)的實用性。
 

 

　　相關(guān)研究成果分別以“Spontaneously Blinkogenic Probe for Wash-Free Single-Molecule Localization-Based Super-Resolution Imaging in Living Cells”和“Super-resolution imaging of cellular pseudopodia dynamics with a target-specific blinkogenic probe”為題，于近日發(fā)表在《德國應(yīng)用化學(xué)》(Angewandte Chemie International Edition)和《中國化學(xué)快報》(Chinese Chemical Letters)上。該工作的共同第一作者為1818組碩士研究生宋澳旋和喬慶龍副研究員，以上研究工作得到國家自然科學(xué)基金、我所創(chuàng)新基金等項目的資助。(文/圖/喬慶龍)