【儀表網(wǎng) 研發(fā)快訊】近日，南京理工大學(xué)電子工程與光電技術(shù)學(xué)院陳錢、左超教授研究團(tuán)隊(duì)提出了一種基于波長(zhǎng)掃描傅里葉疊層衍射層析技術(shù)的新型無(wú)透鏡片上三維顯微成像技術(shù)。該工作以“Lens-free on-chip 3D microscopy based on wavelength-scanning Fourier ptychographic diffraction tomography”為題發(fā)表在國(guó)際頂尖光學(xué)期刊 Light: Science & Applications，并當(dāng)選為期刊內(nèi)封面論文。電光學(xué)院博士生吳雪娟為本文第一作者，我校為第一完成單位和通訊單位。(文章鏈接：https://doi.org/10.1038/s41377-024-01568-1)
 

　　光學(xué)顯微鏡作為生命科學(xué)、醫(yī)學(xué)和材料科學(xué)等領(lǐng)域的核心觀測(cè)工具。然而受拉格朗日不變量等因素的制約，在傳統(tǒng)顯微鏡中分辨率和成像視場(chǎng)之間存在固有的權(quán)衡。隨著生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的基礎(chǔ)研究和前沿技術(shù)的不斷進(jìn)步，對(duì)能夠?qū)崿F(xiàn)跨尺度、高通量顯微成像的需求日益增長(zhǎng)，但傳統(tǒng)顯微鏡普遍無(wú)法兼顧分辨率和視場(chǎng)的雙重要求。
 

　　計(jì)算光學(xué)顯微成像技術(shù)如合成孔徑全息術(shù)、傅里葉疊層顯微術(shù)和無(wú)透鏡片上顯微術(shù)等發(fā)展迅速，為高通量成像提供了新方案。無(wú)透鏡片上顯微術(shù)無(wú)需透鏡，避免視場(chǎng)與分辨率矛盾，在細(xì)胞生物學(xué)、病理篩查、藥物篩選等領(lǐng)域展現(xiàn)出巨大的應(yīng)用潛力。但生物細(xì)胞和組織的三維結(jié)構(gòu)難以用二維透射率函數(shù)表征，光學(xué)衍射層析成像技術(shù)更適合厚樣品。目前，無(wú)透鏡片上層析成像研究較少，多采用機(jī)械光束掃描或多光源陣列照明。傾斜照明會(huì)導(dǎo)致衍射圖樣移位和畸變，大角度照明下數(shù)據(jù)丟失，影響成像分辨率。因此，如何實(shí)現(xiàn)全視場(chǎng)超分辨成像是當(dāng)前面臨的一大挑戰(zhàn)。
 

　　針對(duì)上述問(wèn)題，南京理工大學(xué)陳錢、左超教授研究團(tuán)隊(duì)提出了一種基于波長(zhǎng)掃描傅里葉疊層衍射層析技術(shù)(wavelength-scanning Fourier ptychographic diffraction tomography，簡(jiǎn)稱wsFPDT)的新型無(wú)透鏡片上三維顯微成像技術(shù)，通過(guò)波長(zhǎng)掃描的照明調(diào)控方式實(shí)現(xiàn)三維散射勢(shì)的頻譜填充。與基于多角度照明的無(wú)透鏡三維成像方法相比，該技術(shù)不會(huì)引入圖像移位、畸變等問(wèn)題，實(shí)現(xiàn)了全視場(chǎng)分辨準(zhǔn)均勻、無(wú)標(biāo)記、高通量的衍射層析成像。
 

　　圖1. 基于wsFPDT無(wú)透鏡片上三維成像的基本思想。 (a) 光學(xué)實(shí)驗(yàn)裝置示意圖。(b) 實(shí)驗(yàn)過(guò)程示意圖。(c) wsFDPT重建原理。

 

　　研究團(tuán)隊(duì)搭建了無(wú)透鏡片上三維衍射層析成像的顯微硬件系統(tǒng)(圖1a)，采用單色板級(jí)傳感器記錄原始強(qiáng)度圖，使用超連續(xù)譜光源結(jié)合聲光可調(diào)濾波器進(jìn)行波長(zhǎng)掃描照明。自主開(kāi)發(fā)C++控制軟件實(shí)現(xiàn)聲光可調(diào)諧濾波器與傳感器同步觸發(fā)，可在6秒內(nèi)完成圖像采集。然后基于傅里葉疊層重建算法對(duì)欠采樣的衍射圖樣重復(fù)迭代約束直至收斂，再進(jìn)行非負(fù)約束和全變分正則化相結(jié)合的混合約束處理，獲得樣品像素超分辨的三維折射率分布(圖2)。
 

圖2. wsFPDT方法重構(gòu)算法流程圖。
 

　　為了驗(yàn)證wsFPDT技術(shù)在全視場(chǎng)范圍內(nèi)實(shí)現(xiàn)高通量三維成像的能力，對(duì)傾斜USAF分辨率靶標(biāo)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖3a所示。基于上述系統(tǒng)，wsFPDT獲得了775 nm橫向分辨率和5.43 μm軸向分辨率，超越CMOS傳感器像素尺寸(1.67 μm)采樣限制的2.15倍。進(jìn)一步地，將選定的USAF靶標(biāo)圖案分別水平放置在傳感器的中心和邊緣位置并重復(fù)實(shí)驗(yàn)(圖3b-c)，可以得到近乎相同的成像結(jié)果，表明wsFPDT技術(shù)能夠提供全視場(chǎng)內(nèi)準(zhǔn)均勻的成像分辨率。此外，傾斜的USAF靶標(biāo)被懸空放置，致使其離焦距離相較緊貼傳感器放置時(shí)要遠(yuǎn)離200 μm以上，這說(shuō)明wsFPDT方法在不犧牲橫向成像分辨率的情況下，能夠?qū)崿F(xiàn)超過(guò)200 µm的有效成像深度，該成像深度要比傳統(tǒng)的基于透鏡的光學(xué)衍射層析技術(shù)高出5到10倍。圖4展示了wsFPDT方法對(duì)兩種硅藻進(jìn)行三維重建的結(jié)果，從中可以清晰看到硅藻殼的三維骨架結(jié)構(gòu)及其內(nèi)部復(fù)雜的細(xì)節(jié)信息，該實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證明了wsFPDT方法在處理較厚且具有復(fù)雜軸向結(jié)構(gòu)樣品的三維層析能力。
 

　　圖3.相位分辨率靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。(a) 傾斜放置的分辨率靶標(biāo)的實(shí)驗(yàn)裝置設(shè)計(jì)和重建結(jié)果。(b-c) 選定的靶標(biāo)放置在傳感器不同位置的成像結(jié)果對(duì)比。

 

圖4. C. hibernicus和Naviculold兩種硅藻的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。
 

　　圖5展示了wsFPDT對(duì)無(wú)標(biāo)記小鼠單核巨噬細(xì)胞高通量三維成像的結(jié)果。wsFPDT可以對(duì)全視場(chǎng)(29.85 mm2)內(nèi)所有細(xì)胞同時(shí)實(shí)現(xiàn)定量三維折射率的重建，重建結(jié)果包含約18.3億有效體素，視場(chǎng)范圍覆蓋約32,000個(gè)巨噬細(xì)胞?；谒@得的三維折射率分布，可實(shí)現(xiàn)對(duì)每個(gè)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)參數(shù)(如體積、面積和球形度等)精確的定量分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果不僅驗(yàn)證了wsFPDT針對(duì)大量未染色細(xì)胞集群的高通量三維成像方面的能力，還展示了其在單細(xì)胞層面進(jìn)行定量分析的潛力，將為研究細(xì)胞的結(jié)構(gòu)特征及其對(duì)內(nèi)部和外部刺激(如滲透壓和藥物治療)的反應(yīng)提供重要的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)支持。該方法有望為大規(guī)模細(xì)胞分析、高內(nèi)涵精準(zhǔn)篩選等方面提供重要的影像學(xué)支撐，并在高通量藥物研發(fā)和無(wú)標(biāo)記病理分析等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。
 

圖5. 小鼠單核巨噬細(xì)胞的全視場(chǎng)三維成像。
 

　　上述工作得到了國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃(2022YFA1205002, 2024YFE0101300)，基金委國(guó)家重大科研儀器研制項(xiàng)目(62227818)，江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃前沿引領(lǐng)專項(xiàng)(BK20192003)等資助。