T2毒素檢測試劑盒使用說明書（酶聯(lián)免疫法）

1 原理及用途
T2毒素（T2）是由多種鐮刀菌產(chǎn)生的一種霉菌毒素。主要污染小麥、大麥、玉米等糧食作物及其制品，對人類健康及畜牧業(yè)構(gòu)成了較大危害。T2毒素主要影響血液，肝臟，腎臟，胰腺肌肉及淋巴細胞的功能，T2毒素中毒后的一般臨床癥狀為厭食、嘔吐、腹瀉、生長停滯、繁殖和神經(jīng)機能障礙等。使用T2毒素試劑盒則能夠快速而準確的分析樣品中T2毒素殘留。
本試劑盒采用一步競爭ELISA方法檢測玉米、大米、豆類、花生、燕麥、飼料等樣本中的T2毒素，試劑盒由預包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，酶標板微孔條上預包被T2毒素抗原與樣本中T2毒素競爭抗T2毒素抗體(抗體工作液)，同時抗T2毒素抗體與酶標二抗（酶標記物）相結(jié)合，經(jīng)TMB底物顯色，樣本吸光值與其含有的T2毒素成負相關(guān)，與標準曲線比較再乘以其對應的稀釋倍數(shù)，即可得出樣品中T2毒素的含量。
2 T2毒素檢測試劑盒技術(shù)指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.2ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：25℃，30min～15min
2.3 檢測下限：
花生、玉米、燕麥、大豆、飼料等……………24ppb
小麥………………………………………………20ppb
 2.5 樣本回收率：
花生、玉米、燕麥、大豆、飼料等……………110±15%
小麥………………………………………………110±15%
3 試劑盒組成
酶標板……………………………96孔 
濃縮標準液（黑蓋）：各1ml
0ppb、2ppb、6ppb、18ppb、54ppb、162ppb
酶標記物…………………6ml
抗體工作液………………6ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
10X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
說明書………………………………1份
蓋板膜………………………………1份
自封袋………………………………1份
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質(zhì)器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）、漏斗、濾紙
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：甲醇、二氯甲烷 、去離子水
5 T2毒素檢測試劑盒樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
5.2 配液：
配液1：樣品提取液
用去離子水將甲醇按3∶2體積比進行稀釋（例：30ml甲醇+20ml去離子水）。
5.3.1 花生、玉米、燕麥、大豆、飼料等樣品處理方法
1）取1g粉碎樣品，加入20ml樣品提取液；
2）劇烈振蕩5min；
3）用定量分析濾紙過濾；
4）用蒸餾水或去離子水按1∶5比例稀釋；
5）取50μl進行分析。
稀釋倍數(shù)：120         檢測下限：24ppb
5.3.2 小麥樣品處理方法
1）取1g粉碎樣品，加入20ml樣品提取液；
2）劇烈振蕩5min；
3）用定量分析濾紙過濾；
4）取上清液1ml，加入2ml二氯甲烷，振蕩，4000r/min，離心5min，取二氯甲烷層，于50℃氮氣吹干；
5）加入5ml10%甲醇，振蕩混勻；
6）取50μl進行分析。
稀釋倍數(shù)：100             檢測下限：20ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
實驗開始前需：
配液A：洗滌工作液
將40ml 10×濃縮洗滌液用去離子水按1:9稀釋成400ml工作洗滌液備用，洗滌工作液在4℃環(huán)境可保存一個月。
制備T2毒素標準品：
標準品溶液（0ppb，0.2ppb，0.6ppb，1.8ppb，5.4ppb，16.2ppb）
取6個1.5ml離心管，把標準品濃縮液用去離子水稀釋10倍（如：450ul去離子水加入50ul 標準品濃縮液），現(xiàn)配現(xiàn)用。
6.1 編    號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應30分鐘。
6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次，每次間隔30秒，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘。
6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內(nèi)完成。
7 結(jié)果分析
7.1 百分吸光率的計算
    標準液或樣本的百分吸光率等于標準液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以*個標準液（0ppb）的吸光度值，再乘以，即
 百分吸光度值（%）＝
A
×
A0
A—標準溶液或樣本溶液的平均吸光度值
A0—0ppb標準溶液的平均吸光度值
7.2 標準曲線的繪制與計算
    以標準液百分吸光率為縱坐標，對應的標準液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標，繪制標準液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標準曲線中，從標準曲線上讀出樣本所對應的濃度，乘以其對應的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。
    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準確、快速分析。（索?。?br />8 注意事項
8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導致所有標準的OD值偏低。
8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標準曲線不成線性，重復性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應立即進行下一步操作。
8.3 混合要均勻，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的*性。
8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。
8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。
8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應當棄之。0標準的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。
8.7 反應終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。
9 T2毒素檢測試劑盒貯藏及保存期
儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。
保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。