在過去的十年中，二極管矩陣檢測器(PDA)已成為HPLC系統(tǒng)中zui常用的UV/VIS檢測器之一。這種趨勢的主要原因在于，采用PDA進(jìn)行檢測在獲得定量數(shù)據(jù)的同時，還可獲取定性數(shù)據(jù)，如吸收光譜。對于特定分析，在確定*檢測波長時，采集的光譜數(shù)據(jù)是非常有用處的。光譜也常用于化合物的鑒定。分析專家經(jīng)常使用光譜信息來確定是否存在由于被檢測物質(zhì)降解或轉(zhuǎn)化所生成的雜質(zhì)。因此，PDA在分析研究、方法開發(fā)和藥物代謝實(shí)驗(yàn)中，得到了廣泛的發(fā)展。
靈敏度對于任何檢測器而言，都是zui重要的指標(biāo)。過去的PDA，盡管可提供重要的定性信息，但其靈敏度要遜于目前的可變波長紫外/可見檢測器。在1997年TSP公司開發(fā)出新產(chǎn)品UV6000LP(PDA)之前的十年中，PDA在靈敏度提高方面進(jìn)展甚微。與目前的可變波長紫外檢測器相比，由于UV6000LP采用了全新的技術(shù)產(chǎn)品--50mm光導(dǎo)管流通池，從而*地提高了PDA的靈敏度。
本文中，我們將舉例說明，用UV6000LP測定抗生素Cephalexin(*)，其檢測極限降低了四倍，而在以往這只能依靠高靈敏度的可變波長檢測器來實(shí)現(xiàn)。
靈敏度對化合物鑒定的重要性：
高靈敏度檢測器，可帶來諸多便利。首先檢測極限的降低，使分析人員可檢測含量更低的化合物。此外，在低檢出量時，高靈敏度增加了數(shù)據(jù)的可信度，從而提高了定性分析的準(zhǔn)確性。對于PDA檢測器而言，的靈敏度有著更為重要的意義。由于PDA可提供光譜信息，因此由高靈敏度而產(chǎn)生的高質(zhì)量光譜圖，使得未知物鑒定更為容易。
降低基線噪音的挑戰(zhàn)：
描述一個給定檢測器相對靈敏度zui重要的指標(biāo)是它的信噪比。提高檢測器靈敏度有兩種可行的方法：增加所給出樣品的信號，或降低短程基線噪音。
檢測器的基線噪音主要有四個影響因素：
1. 當(dāng)光強(qiáng)很大時，可變波長使用的硅 光電二極管和二極管矩陣檢測器性能*。當(dāng)光強(qiáng)減弱時，短程噪音隨之增加。因此在設(shè)計檢測器時，應(yīng)盡可能地增加光通過量。
2. 模擬電路和光電構(gòu)件均造成短程噪音，而且這些構(gòu)件都是定制的，因此在制作時要綜合考慮成本和性能兩個方面。
3. 檢測器靈敏的模擬電路，受微處理器，變壓器和電源的電磁干擾(EMI)。受檢測器體積的限定，很難將模擬電路與發(fā)射EMI的原件隔開。
4. 在信號處理中，模擬和數(shù)字過濾也會影響基線噪音。有兩種常用的過濾器可用來降低檢測器的基線噪音。響應(yīng)時間過濾器用在時間軸線上，而頻帶寬度過濾器則用在波長軸線上，但存在著二者相互關(guān)聯(lián)的綜合考慮問題。盡管二者都能很好地工作，并且降低了基線的噪音，但一超過兩秒鐘，響應(yīng)時間過濾器就會引起頻帶擴(kuò)展，從而降低色譜的分辯率。在另一軸上，頻帶寬度過濾器在提高靈敏度的同時也降低了光譜分辯率。
| 基于以上因素，近年來，液相色譜檢測器制造商很少采用通過降低短程噪音的方法來增加檢測器的靈敏度。 圖1. 采用光導(dǎo)管流通池增加信號： 現(xiàn)在，我們討論一下影響靈敏度的另一個因素--信號。比爾朗伯定律表明了一種化合物的吸收值與其自身摩爾吸收率(S)，流通池的長度(b)及樣品的濃度(c)之間的關(guān)系。*(S)和第三(c)因素，均無法提供改進(jìn)檢測器靈敏度的途徑。然而，增加檢測器流通池的長度，則可成倍增加檢測器的信號。 | 圖 1 | ||||||||||||||||||
| 的光導(dǎo)管流通池內(nèi)壁由一種特殊材料制成，可將光信號全部反射回流通池中部，而管壁不吸收任何光信號，因而易于降低短程基線噪音。根據(jù)內(nèi)部折射加和的光纖通信基礎(chǔ)技術(shù)原理，的光導(dǎo)管流通池將其光程增至為50mm。而體積同為10ml的一般檢測器，其流通池光程僅為10mm。所以，根據(jù)比爾定律，增加光程因子5倍可引起信號因子增加5倍。 降低Cephalexin的檢測極限： 根據(jù)制藥管理規(guī)定，成品藥中的降解雜質(zhì)含量不得超過0.1%。Cephalexin是一種不穩(wěn)定的抗生素，因此制藥廠必須做降解產(chǎn)物的常規(guī)分析。 圖1所示：分析一個10ng Cephalexin試樣，將其注入一個Hypersil?C8(10cm, 5mm)色譜柱。HPLC系統(tǒng)由TSP的 SpectraSystem體系構(gòu)成，包括一個P4000梯度泵、AS3000自動進(jìn)樣器和一個可變波長檢測器(帶常規(guī)10mm流通池)。同時，此系統(tǒng)與UV6000LP二極管矩陣檢測器(帶50mm流通池)聯(lián)接。兩個檢測器測定波長均為260mm，即在Cephalexinzui大吸收波長處。使用新的ChromQuest?軟件控制HPLC系統(tǒng)，并提供光譜分析和譜庫對比功能。
以上結(jié)果顯示出，UV6000LP是如何通過增加靈敏度而降低Cephalexin的 LOD和LOQ值的。UV6000LP與可變波長檢測器相比，由于性能的改進(jìn)，使得其LOD值比原來降低了大約70%。此例也表明，檢測和定量分析比以前含量更低的化合物已成為可能 。 | |||||||||||||||||||
| 更好的定量精度： 增加靈敏度的另一好處，便是改善了低含量樣品數(shù)據(jù)的精度。為了說明該效應(yīng)，我 們配制樣品濃度為100pg-500pg，在此濃度范圍內(nèi)反復(fù)進(jìn)樣。在每一濃度下，將所得到的檢測器響應(yīng)值進(jìn)行平均，并計算出其%RSD。 表2. 低樣品含量的峰高精度
圖2所示為試樣從150pg到250pg范圍內(nèi)可變波長檢測器的較正曲線。在試樣濃度100pg時，其響應(yīng)值是測不到的。較正曲線相關(guān)較正系數(shù)為0.9965。圖3所示為同樣樣品濃度范圍內(nèi)UV6000LP的校正曲線。因?yàn)閁V6000LP有較高的靈敏度，所以在樣品濃度為100pg時有響應(yīng)值。曲線在此點(diǎn)有響應(yīng)值，并不影響相關(guān)系數(shù)，相關(guān)因子仍增到0.9992--這說明UV6000LP在低含量的精度有顯著的改進(jìn)。圖4從另一角度來說明UV6000LP的特性。將兩種檢測器在不同濃度下的RSD值作圖?？勺儾ㄩL檢測器在150pg濃度時，RSD約為85%左右，這對檢測工作無太大的意義。只有濃度提高到250pg，檢測器的值才呈現(xiàn)出常數(shù)。然而，對于UV6000LP，在150pg即有響應(yīng)值了。 此例說明了由于UV6000LP采用"光導(dǎo)管"技術(shù)，從而在低樣品含量檢測時，大大改進(jìn)其數(shù)據(jù)的定量精度。表2總結(jié)了在不同水平的%RSD數(shù)據(jù)。 | 圖 3 圖4 | |||||||||||||||||||||||
更高質(zhì)量的光譜： 以上示例說明增加靈敏度可以改善定量數(shù)據(jù)，即使得低含量化合物的精確測量和定量成為可能。由PDA產(chǎn)生的吸收光譜，常用于不純物質(zhì)的定性鑒別。例如，吸收光譜可用于鑒定雜質(zhì)是否來自于主要成份的降解產(chǎn)物，或者產(chǎn)品生產(chǎn)過程是否發(fā)生變化。 該實(shí)驗(yàn)同樣表明，對于低含量樣品，較高的靈敏度可產(chǎn)生較強(qiáng)的信號，從而光譜數(shù)據(jù)得以改進(jìn)。對一個480pg的Cephalexin樣品（zui低檢出限）進(jìn)行檢驗(yàn)。ChromQuest™軟件將它的吸收光譜與參考譜庫進(jìn)行比較。該試樣與以往用一個大劑量樣品所做的譜圖相匹配，其譜庫匹配系數(shù)為992。當(dāng)匹配系數(shù)大于990，則意味著互相關(guān)聯(lián)程度較大。 此例說明，SpectraSYSTEMUV6000LP并不像以往的PDA那樣，在提高光譜靈敏度的同時，降低分辯率。 結(jié)論： 本文討論了檢測器靈敏度對色譜儀的重要性。盡管一些因素制約了檢測器靈敏度的提高，但TSP仍成功地將內(nèi)折射加和原理和比爾朗伯定律運(yùn)用在HPLC流通池的開發(fā)中，其光導(dǎo)管流通池的靈敏度提高了五倍。靈敏度（信噪比）的顯著提高反過來使LOD和LOQ值降低了五倍。以上數(shù)據(jù)清晰地表明，改善了靈敏度的UV6000LP，為分析人員定量和定性分析提供了更加可靠的信息。 | ||||||||||||||||||||||||
| UV6000LP 光電二極管陣列檢測器規(guī)格指標(biāo) | |
| Wavelength Range 190 - 800nm | Rise time Filter Bessel 0.1 to 10 sec |
| Wavelength Accuracy ± 1nm @ 254nm | Bandwidth Filter Savitsky-Golay, 1 nm - 59 nm |
| Array 512 pixels | Analog Outputs 2 unattenuated 20-bit at 10 mV, 100mV or 1V per AU |
| Spectral Resolution 1.2 nm, digital | Data Rate 0.5 - 20 Hz |
| Absorbance Linearity ＊2.0 AU @ 254nm | Digital Inputs Run and zero |
| Cell Pathlength 50 nm | Digital Outputs Run, ready and event |
| Drift＊ 1 ′10-3 AU/hr @ 254 nm | Dimensions 18 cm ′ 34 cm ′ 43 cm (H′W′D) |
| ＊ASTM E1657-94, per 10 mm pathlength, 4 mm bandwidth, 2 sec rise, MeOH 1mL/min | |
