瑞典Attana公司制造的Attana Cell 200蛋白互作分析儀，是一種無(wú)需標(biāo)記、可直接在細(xì)胞表面測(cè)量分子相互作用的生物傳感器，其傳統(tǒng)生物傳感器與基于細(xì)胞的分析方法之間的空白。
Attana蛋白互作分析儀依托于石英晶體微天平（Quartz Crystal Microbalance，簡(jiǎn)稱(chēng)QCM）技術(shù)，外加的交流電勢(shì)使石英晶體在共振頻率下震動(dòng)，當(dāng)分子流經(jīng)晶體并與表面結(jié)合，振動(dòng)頻率會(huì)發(fā)生變化，其頻率差異可以用來(lái)反映實(shí)時(shí)的分子相互作用。
自2010年上市以來(lái)，Attana Cell 200蛋白互作分析儀已廣泛用于蛋白互作、蛋白細(xì)胞互作、抗體藥研發(fā)等領(lǐng)域，贏得了包括大學(xué)、藥企、CRO實(shí)驗(yàn)室的信任，與制藥化工Lonza集團(tuán)、胰島素研發(fā)明星諾和諾德等長(zhǎng)期合作。
相比傳統(tǒng)分子互作檢測(cè)技術(shù)，Attana開(kāi)創(chuàng)了直接在細(xì)胞層面進(jìn)行實(shí)時(shí)原位分子結(jié)合動(dòng)力學(xué)的檢測(cè)方法，更準(zhǔn)確地反映了體內(nèi)環(huán)境的分子間互作，能夠高質(zhì)量、精確地研究其特異性、動(dòng)力學(xué)和親和力。
Attana Cell 200蛋白互作分析儀檢測(cè)優(yōu)勢(shì)
1、可檢測(cè)蛋白與細(xì)胞的相互作用
2、可檢測(cè)蛋白與組織切片的相互作用
3、可檢測(cè)細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用
4、可使用粗制蛋白樣品
Attana蛋白互作分析儀應(yīng)用實(shí)例
用QCM技術(shù)檢測(cè)蛋白藥物與腫瘤組織切片的親和動(dòng)力學(xué)
長(zhǎng)久以來(lái)，將癌癥組織用甲醛固定石蠟包埋（FFPE）后做組織切片，進(jìn)行免疫組化（IHC）分析，是癌癥相關(guān)抗原的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)方法。但免疫組化本身很難定量抗體與癌癥相關(guān)抗原結(jié)合的特異性和親和力。Clausen等人建立了一套以Attana Cell 200 QCM技術(shù)為核心，直接在組織切片上進(jìn)行實(shí)時(shí)原位分子親和動(dòng)力學(xué)的檢測(cè)方法。
研究者直接在FFPE人胎盤(pán)組織、乳腺癌和前列腺腫瘤標(biāo)本中，測(cè)定了rVAR2蛋白與它的胎盤(pán)樣（pl-CS）受體之間的相互作用，發(fā)現(xiàn)rVAR2與FFPE人胎盤(pán)、腫瘤組織存在納摩爾級(jí)的親和力，與pl-CS陰性的正常組織無(wú)相互作用。
進(jìn)一步用雄激素受體N-20的抗體（抗AR）對(duì)此方法進(jìn)行評(píng)估，發(fā)現(xiàn)Attana得出的KD值與可用抗原表位的數(shù)量無(wú)關(guān)，表明Attana不僅能在組織標(biāo)本上直接對(duì)抗原-抗體結(jié)合親和力進(jìn)行定量，還能評(píng)估抗體所能識(shí)別的抗原表位的數(shù)量。
基于這些結(jié)果，研究者認(rèn)為Attana QCM技術(shù)不僅可用于挑選生物制劑，還能用于開(kāi)發(fā)新型高親和力的藥物。（Clausen, T. M., et al. Real-time and label free determination of ligａnd binding-kinetics to primary cancer tissue specimens; a novel tool for the assessment of biomarker targeting. Sens Biosensing Res. 2016; 9: 23-30.）
圖1.Attana Cell 200蛋白互作分析儀與COP-1檢測(cè)芯片。
圖2.免疫組化鑒定為陽(yáng)性的甲醛固定石蠟包埋組織樣品被切成5μm厚的薄片，并固定在COP-1芯片中心。
圖3.（b）Attana測(cè)定出rVAR2蛋白與胎盤(pán)組織的KD值為4.27nM，具有高親和力。（c）當(dāng)添加了能抑制rVAR2粘附于胎盤(pán)組織的CSA溶液后，rVAR2蛋白與胎盤(pán)組織的結(jié)合曲線不再有明顯的結(jié)合點(diǎn)和解離點(diǎn)。
圖4.（a）免疫組化結(jié)果顯示，與作為正常組織對(duì)照的扁桃體組織切片相比，rVAR2蛋白與乳腺癌、前列腺腫瘤組織切片有強(qiáng)相互作用，進(jìn)一步用Attana測(cè)定其KD值分別為8.9nM和6.65nM，而與扁桃體組織的結(jié)合曲線無(wú)明顯的結(jié)合點(diǎn)和解離點(diǎn)，無(wú)法測(cè)出其KD值。（b和c）用V5-FITC的抗體對(duì)rVAR2蛋白進(jìn)行定位，進(jìn)一步驗(yàn)證了Attana得到的結(jié)果，即rVAR2蛋白與前列腺腫瘤組織切片強(qiáng)結(jié)合，而不與扁桃體組織結(jié)合。證明Attana能準(zhǔn)確對(duì)組織切片上抗原-抗體的親和力進(jìn)行定性和定量。
圖5.檢測(cè)發(fā)現(xiàn)純化的胎盤(pán)樣（pl-CS）受體與rVAR2蛋白的KD值為3.6nM，具有強(qiáng)結(jié)合，證明Attana可準(zhǔn)確檢測(cè)純化蛋白間的相互作用。
圖6.將乳腺癌細(xì)胞(SKBR3)、前列腺癌細(xì)胞(LNCap)與中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞（CHO）相比，免疫組化和Attana的結(jié)果一致，乳腺癌細(xì)胞與前列腺癌細(xì)胞均檢測(cè)到細(xì)胞與rVAR2蛋白有著很強(qiáng)的親和力。
圖7.高表達(dá)AR的Lncap細(xì)胞與AR抗體有強(qiáng)的親和力，而雄激素非依賴(lài)的PC3與AR抗體的親和力相對(duì)較弱。這一結(jié)果進(jìn)一步在細(xì)胞水平上證明了Attana具有廣泛的兼容性。
圖8.采用Attana對(duì)AR抗體與FFPE組織切片的親和力檢測(cè)結(jié)果，與免疫組化結(jié)果一致，即免疫組化陽(yáng)性的FFPE前列腺癌組織，對(duì)AR抗體有強(qiáng)的親和力，免疫組化陰性的FFPE胎盤(pán)組織，對(duì)AR抗體無(wú)相互作用。這一結(jié)果在組織切片水平上也證明了Attana能有效監(jiān)測(cè)抗體與切片的結(jié)合。
實(shí)驗(yàn)操作總結(jié)：
1、組織切片如何固定在COP-1芯片上？
Attana的COP-1芯片在室溫用聚L-賴(lài)氨酸溶液包被5分鐘。包被后，用PBST沖洗芯片，并在室溫干燥2小時(shí)。將甲醛固定石蠟包埋（FFPE）組織樣品切成5μm厚的薄片，并貼在芯片上，60℃烘烤1h。
2、脫蠟和抗原修復(fù)
將COP-1芯片上的組織樣品浸沒(méi)在EZprep溶液中，65℃水浴30min進(jìn)行脫蠟。之后PBS洗3次。再在95℃下，用pH6.0的10mM檸檬酸鈉、0.05％吐溫溶液浸泡30min進(jìn)行抗原修復(fù)。
