LIMA™是一種基于寬帶可調(diào)諧激光光源的高光譜顯微鏡。它采用Photon etc.濾波技術(shù)，配合連續(xù)可調(diào)的單色光、高功率密度激光進(jìn)行全視野照明。系統(tǒng)在可見(jiàn)光，近紅外，和短波紅外，都有很好的光譜分辨能力，使其能夠提供接近衍射極限的空間分辨率，無(wú)論暗場(chǎng)、激發(fā)光譜、標(biāo)準(zhǔn)明場(chǎng)反射或透射成像，該系統(tǒng)的全光譜響應(yīng)速度遠(yuǎn)超點(diǎn)掃描、線掃描的設(shè)備。
技術(shù)指標(biāo) | VIS | SWIR | eSWIR | VIS-SWIR |
激發(fā)光譜范圍 | 400 – 1000nm
| 900 – 1620nm | 1000 – 2500nm | 400- 1620nm |
激發(fā)光譜分辨率 （FWHM） | 1.5 - 2.5nm | 3.0 - 5.0nm | < 5.0 nm | 1.5 - 5.0nm |
激發(fā)波長(zhǎng) | 連續(xù)可協(xié)調(diào)激光器 | 連續(xù)可協(xié)調(diào)激光器 | 連續(xù)可協(xié)調(diào)激光器 | 連續(xù)可協(xié)調(diào)激光器 |
帶外抑制 | < -60 db = ± 40 納米 | < -60 db = ± 80 納米 | < -60 db = ± 80 納米 | < -60 dB = ± 40 納米 （VIS） 或 80 nm （SWIR） |
可調(diào)諧激光光源輸出功率 | 2 – 4mW | 3 – 9mW | 0.5 - 8.0mW | 2 – 9mW |
照明 | 高效均勻照明；立體熒光或表面熒光，明場(chǎng)或暗場(chǎng)（油鏡、干鏡） | |||
空間分辨率 | 亞微米 -（與顯微鏡目鏡數(shù)值孔徑相關(guān)） | |||
相機(jī) | sCMOS（可選CCD，EMCCD） | ZephIR™ 1.7 或者 Alizé™ 1.7 (InGaAs) | ZephIR™ 2.5 (HgCdTe) | sCMOS 和 ZephIR™ 1.7 or Alizé™ 1.7 |
顯微鏡 | 直立或倒置科研級(jí)顯微鏡 | |||
白光照明 | 透鏡、反射、汞燈、鹵素?zé)?/span> | |||
應(yīng)用案例
金納米粒子的高光譜暗場(chǎng)表征:識(shí)別和定位
暗場(chǎng)顯微鏡結(jié)合高光譜成像技術(shù)，為研究組織、活細(xì)胞或溶液中的納米材料提供了一種行之有效的方法。來(lái)自等離子體或其他納米結(jié)構(gòu)的散射光，提供了關(guān)于其組成、大小和分布的相關(guān)信息。Photon提供了兩種不同的高光譜暗場(chǎng)成像平臺(tái):一種基于可調(diào)諧激光光源(TLS)，在激勵(lì)下進(jìn)行濾波和IMA圖像處理，一種提供了發(fā)射濾波的平臺(tái)。
可調(diào)諧激光光源系統(tǒng)（TLS）由兩個(gè)模塊組成，基于Photon etc.體布拉格光柵(VBG)技術(shù)的超連續(xù)光源(寬帶光源)和激光線可調(diào)諧濾波器(LLTF -帶通濾波器)。
IMA則由同樣基于體布拉格光柵(VBG)技術(shù)的高光譜成像濾波器、“超立方體（hypercube）”組成。當(dāng)與配備暗場(chǎng)電容器的科研級(jí)顯微鏡組合時(shí)，TLS和超立方體可以將該顯微鏡轉(zhuǎn)換為高光譜暗場(chǎng)設(shè)備，這些系統(tǒng)在可見(jiàn)光范圍 (400-1000 nm)， 近紅外范圍 (900-1620) nm或可見(jiàn)-近紅外范圍(400-1620 nm)內(nèi)連續(xù)可調(diào)。該平臺(tái)可以無(wú)需特殊樣品制備的情況下，即可對(duì)納米材料進(jìn)行深入的表征。
TLS結(jié)果示例
在該研究中，Patskovsky等人利用高光譜暗場(chǎng)成像技術(shù)研究了靶向CD44+人乳腺癌細(xì)胞的金等離子體納米顆粒(AuNPs)。該方法已成功應(yīng)用于三維光譜定位和光譜分析。
“這種空間和光譜信息對(duì)于改進(jìn)基于納米等離子體的成像、復(fù)雜生物環(huán)境中的疾病檢測(cè)和治療至關(guān)重要。”
圖一，使用100X物鏡沿光學(xué)z軸在不同平面拍攝的暗場(chǎng)圖像。焦平面位于
a)玻璃基板表面(S點(diǎn))或b)人類乳腺癌細(xì)胞的上表面或細(xì)胞內(nèi)部(C點(diǎn))
Photon etc與華盛頓大學(xué)的David Ginger教授合作，利用Photon公司的高光譜暗場(chǎng)成像儀研究了100納米金納米顆粒。從432 nm到849 nm，以3 nm的步長(zhǎng)采集散射數(shù)據(jù)。高光譜結(jié)果如圖2 a)和b)顯示，圖c)為從數(shù)據(jù)中提取的光譜圖，波長(zhǎng)的變化可以幫助確定粒子的大小，而空間信息可以幫助評(píng)估它們的分布。
圖2 - a)從高光譜數(shù)據(jù)中提取的576 nm暗場(chǎng)圖像，b)區(qū)域放大圖，c)提取的散射光譜-顏色為對(duì)應(yīng)的采集點(diǎn)。
IMA結(jié)果示例
在École Polytechnique de Montréal的Michel Meunier教授的研究小組的這項(xiàng)工作中，IMA被用于表征用金納米顆粒(AuNPs)標(biāo)記的人類乳腺癌細(xì)胞。Photon公司的高通量高光譜濾光片可以快速獲取高分辨率光譜圖像。相機(jī)可以在視野中捕捉到整個(gè)圖像，因此可以實(shí)時(shí)收集信息，并跟蹤細(xì)胞和發(fā)光納米級(jí)組件的動(dòng)態(tài)。 Photon 公司的PHySpec™軟件支持主成分分析功能（PCA），以識(shí)別并定位樣品中的納米顆粒。
圖3a)為60 nm AuNps標(biāo)記MDA-MB-23人乳腺癌細(xì)胞的暗場(chǎng)圖像。在60倍物鏡下，對(duì)150 × 112 μm2的視野區(qū)域從400 nm到650 nm成像，步長(zhǎng)為2 nm，每個(gè)波長(zhǎng)信號(hào)積累時(shí)間為2秒。細(xì)胞一般具有平坦的散射光譜，而金納米顆粒AuNPs在550 nm左右有一個(gè)尖峰。圖3b)為從乳腺癌的暗場(chǎng)高光譜數(shù)據(jù)中提取的550 nm圖像。在PCA 后，金納米顆粒用綠色標(biāo)記。 (圖3c)為乳腺癌細(xì)胞的放大圖， (圖3d)為含有AuNPs區(qū)域的光譜，證實(shí)了60 nm納米顆粒的存在。
圖3 - a) 60 nm大小的AuNps標(biāo)記的人乳腺癌細(xì)胞暗場(chǎng)圖像，b) 550 nm單色圖像，PCA后的AuNps用綠色標(biāo)記，c)癌細(xì)胞放大圖，d)不同區(qū)域AuNps的擴(kuò)散光譜(見(jiàn)對(duì)應(yīng)圖c)
