非洲豬瘟病毒熒光PCR試劑盒（柱膜法）使用說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：病毒DNA提取試劑盒
英文名稱：Extraction Kit for Virus DNA
【預(yù)期用途】
本試劑盒主要用于疑似病毒等病原感染抗凝血、血淸、拭子、組織、飼料及環(huán)境中的病毒DNA的提取，純化的核酸可適用于各種常規(guī)操作及PCR試驗。
【試劑盒組分】
I、試劑盒組成及貯藏條件
名稱 | 20 T | 50 T |
1、吸附柱 | 20個 | 50個 |
2、收集管 | 20個 | 50個 |
3、裂解液 | 5 mL | 11 mL |
4、洗液I | 13 mL | 32 mL |
5,洗液II | 13 mL | 32 mL |
6.洗脫液 | 1.2 mL | 3 mL |
2、 保存條件及有效期：室溫下保存，有效期12個月.
3、 需自備材料：無水乙醇、1.5 mL無菌離心管、1.5 mL無菌離心管（長臂型）、生理鹽水、研缽、無菌
1mL, 2OOuL、10uL槍頭、記號筆等。
非洲豬瘟病毒熒光PCR試劑盒【操作步驟】
一、樣品制備
1、 血液樣品：抗凝血樣品置離心管中，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上層血漿；非抗凝血樣品置離心 管中，待凝固后，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上層血清，置于滅菌離心管中，編號待檢。
2、 組織樣品：采集脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體等病變組織樣品0.1g.組織勻漿器或研缽中充分勻漿或研磨，加入1 mL生理鹽水混勻，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心骨中，編號待檢。
3、 口腔液：進食前用拭子/口腔液采集袋或自制棉線綁紗布團吸引動物咀嚼，收集口腔液大于 500uL， 8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心管中，編號待檢。
4、 飼料：取適量研磨后的飼料（約0.2g），放入含1 mL生理鹽水或PBS（PH為7.4）緩沖液的2 mL EP 管屮，振蕩混勻，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心管中,編號待檢.
5、 灰塵：用無菌棉簽蘸取適量環(huán)境表面上的灰塵，放入含1 mL生理鹽水或PBS（PH為7.4）緩沖液的2 mL EP管中，振蕩混勻，8000轉(zhuǎn)/分鐘離心2分鐘，取上清于滅菌離心管中，編號待檢。
二、DNA的提取
1、取裂解液200uL加入無核酸酶1.5 mL離心曾屮，分別加入血漿/血清/組織液等樣品液200uL. 震蕩混勻10秒或顛倒混勻10次，室溫放置5分鐘（如果室內(nèi)溫度較低時.需放置25C水浴溫育），再加入200uL無水乙醇，顛倒混勻10秒；若樣品渾濁則先12000轉(zhuǎn)/分鐘離心1分鐘處理，取上清液，以避免堵塞柱子；
2、 將液體轉(zhuǎn)入套有收集管的吸附柱中， 12000rpm離心1分鐘：
3、 棄收集管液體，向吸附柱中加600uL洗液I , 12000 rpm離心1分鐘;
4、 棄收集管液體，向吸附柱中加600uL洗液II， 12000 rpm離心I分鐘；
5、 棄收集管液體，12000 rpm離心2分鐘，以*去除殘留洗液；
6、將吸附柱轉(zhuǎn)入新的無核酸酸1.5mLEP管（長臂型）中，向柱中央滴加50 uL洗脫液，靜置1分鐘, 12000 rpm離心1分鐘，EP管中液體即為病毒DNA。
【注意事項】
1、 實驗前諾仔細閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按照操作步驟執(zhí)行.在操作過程中對時間、試劑體積等 粘確控制可以獲得好的結(jié)果。
2, 樣本應(yīng)新鮮采集使用，或低溫運輸儲存；
3, 樣本具有潛在感染風(fēng)險，核酸的提取應(yīng)在核酸提取實驗室的生物安全柜中進行。
4、 核酸提取冇關(guān)耗材確保高溫滅菌，提取后核酸盡快進入下一步試驗或冷凍保存待用。
5, 試劑使用前應(yīng)混合均勻，試劑具有一定腐蝕性，使用時請戴手套、口罩做好防護。
6. 低溫下裂解液出現(xiàn)結(jié)晶數(shù)屬正?，F(xiàn)象，可在60°C水浴加熱助溶后使用。
7、 實驗產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)及時收集，遠離PCR實驗室進行無害化處理。
僅供獸醫(yī)診斷使用
非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒說明書
【獸藥名稱】
通用名稱：非洲豬瘟病毒熒光PCR核酸檢測試劑盒
漢語拼音:Feizliouzhuwen Bingdu Yingguang PCR Hesuan Jianceshijihe
英文名稱：African swine Fever Virus (ASFV) PCR Nucleic Acid Diagnostic Kit
商品名稱：無
【主要成分與含量】試劑盒中含有如下組分:
試劑盒組分 | 含量 |
陽性對照 | 250μL/管×1管
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陰性對照 | 250μL/管×1管
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PCR反應(yīng)液 | 850μL/管×1管
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萌混合液 | 150μL/管×1管
|
說明書 | 1份/盒 |
【作用與用途】 本試劑盒可用于血液、脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、 樣品中非洲豬瘟病毒核酸的檢測。 扁桃體、腎臟、肌肉、環(huán)境樣品等 | |
【用法與判定】
1 用法
1.1待檢樣品釆集、保存及運輸
1.1.1樣品釆集
（1） 活豬樣品 無菌采集抗凝血或血清5mL
（2） 病死豬剖檢樣品或屠宰場剖檢樣品 無菌采集死豬的牌、肺、腎、扁桃體、淋巴結(jié)、肌肉等組織樣品。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。
（3） 病豬污染的周邊環(huán)境 采集與病豬相關(guān)場所的糞便、飼料、污水樣品。2?8°C低溫運至實驗室用于檢測。
1.1.2樣品保存 采集的樣品在2?8°C保存應(yīng)不超過24小時，-70°C條件下保存，避免反復(fù)凍 融。
1.1.3樣品運輸泡沫箱加冰袋后密封進行運輸。包裝和運輸應(yīng)符合農(nóng)業(yè)農(nóng)村部《高致病性動 物病原微生物菌（毒）種或者樣品運輸包裝規(guī)范》和交通運輸部門關(guān)于危險品運輸管理的有關(guān)規(guī)定。
1.2樣品處理
1.2.1血液樣品處理 抗凝血樣品置于離心管中，8000 r/min離心2分鐘取上層血漿，編號待 檢。非抗凝血樣品置于離心管中，待凝固后，8000 r/min離心2分鐘取200μL上層血清，編號待檢。
1.2.2組織樣品處理取適量脾臟、肝臟、淋巴結(jié)、扁桃體、肌肉等組織，置于研磨器或研磨管中研磨，再加適量生理鹽水混勻，制成約10%的組織勻漿，8000 r/min離心2分鐘，取200μL上 清于RNase/DNase-free無菌離心管中，編號備用。
1.2.3環(huán)境樣品處理
1.2.3.1糞便、飼料樣品處理方法取適量的糞便、飼料放入盛有PBS緩沖液的研磨管中研磨混勻，制成約10%的勻漿液.8000 r/min離心2分鐘，取200μL上清于RNase/DNase-free無菌離心 管中，編號備用。
1.2.3.2污水樣品處理方法 直接取200μL污水進行核酸提取。
1.3病毒核酸的提取用磁珠法或柱式法進行DNA核酸提取。
1.4熒光PCR反應(yīng)：
1.4.1從試劑盒中取出熒光PCR反應(yīng)液、酶混合液，室溫融化后，2000 r/min離心5秒。設(shè)被 檢樣品、陽性對照和陰性對照總和為n,則反應(yīng)體系配制如下：
試劑 體系
PCR 反應(yīng)液 17× (n+1) μL
酶混合液 3× (n+1) μL
1.4.2在新的RNase/DNase-fire 1.5 ml離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照20μL/ 管分裝量將試劑分裝至熒光PCR反應(yīng)管。
1.4.3在上述制備好的熒光PCR反應(yīng)管中分別加入陰性對照、陽性對照各5μL、處理好的待測核酸各5μL,終體積25μL/管，蓋好熒光PCR反應(yīng)管蓋，混勻后瞬時離心，轉(zhuǎn)移到熒光PCR儀器 上。
144將PCR反應(yīng)管放置在熒光PCR儀樣品槽中，在熒光PCR儀上運行以下程序：
步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 50 ℃, 2分鐘 | 1 |
預(yù)變性 | 95 ℃, 3分鐘 | 1 |
預(yù)擴增 | 95 ℃： 8 秒 55 ℃： 8 秒
| 5 |
PCR擴増 | 95 ℃： 8 秒 55 ℃： 8 秒
| 40 |
熒光通道選擇FAM,在PCR擴增階段每個循環(huán)的55℃時采集熒光信號。設(shè)置擴增體系為25μL, 同時要選擇passive reference和quencher為none的模式。（注：若熒光PCR儀（如AB17500）按說明 書中的反應(yīng)程序設(shè)置后因持溫時間短無法運行，可將預(yù)擴增和PCR擴增條件變更為95C： 5秒 55°C： 30 秒）
2結(jié)果判定
2.1試驗有效性判定
陽性對照有典型擴增曲線且Ct值≤30.且陰性對照無Cl值或無擴增曲線，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期。則判試驗結(jié)果有效。否則，此次試驗視為無效。
2.2樣品判定
2.2.1陽性：樣本檢測結(jié)果Ct值≤35且有明顯指數(shù)增長期，判定檢出非洲豬瘟病毒核酸。
2.2.2可疑：樣本檢測結(jié)果Ct值在35?38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對樣本進行重復(fù)檢測，如果重復(fù)實驗 結(jié)果Ct值仍在35?38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期.則判定為陽性，否則為陰性。
2.2.3陰性：樣本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值，判定未檢出非洲豬瘟病毒核酸。
【注意事項】（1）實驗前請仔細閱讀本試劑盒說明書，嚴(yán)格按照操作步驟執(zhí)行，在操作過 程中對時間、試劑體積等精確控制可以獲得好的結(jié)果。
（2） 實驗室應(yīng)嚴(yán)格按照有關(guān)規(guī)定分區(qū)管理，依照配液區(qū)-模板提取區(qū)-擴增區(qū)-分析區(qū)順序 進行基因檢測。各區(qū)間人員、器材、試劑及空氣流向應(yīng)有嚴(yán)格要求。
（3） 核酸提取有關(guān)耗村確保潔凈、無DNase/RNase,提取過程盡量低溫、快速，完成后進入 下一步實驗或凍保。
（4） 對于頂部采光儀器要帶新的一次性PE手套對熒光PCR管封蓋，對于底部采光儀
器要避免徒手或使用過的手套接觸熒光PCR管底，檢測過程中使用不帶熒光物質(zhì)一次性乳膠手套。
（5） 凍存試劑使用前應(yīng)于室溫下*融化，瞬時離心使液體*沉于管底。避免反復(fù)凍融， 以免影響試劑性能。
（6） 樣品、陽性對照等在使用后及時封蓋，.避免組分間及氣溶膠等的污染造成假陽性。
（7） 擴增產(chǎn)物禁止開蓋，實驗產(chǎn)生的廢棄物應(yīng)及時收集，遠離PCR實驗室進行無害化處理。
【規(guī)格】50頭份/盒
【貯藏與有效期】試劑盒置-20°C以下避光保存，有效期12個月。
【批準(zhǔn)文號】獸藥生字163668871
【生產(chǎn)企業(yè)】鄭州中道生物技術(shù)有限公司
僅供獸醫(yī)診斷使用
