糖化血紅蛋白HbA1 c的構(gòu)成
● 糖化血紅蛋白(Hemoglobin， Hb) 是指血糖和紅細(xì)胞中的血紅蛋白之間形成的非酶促的蛋白糖化反應(yīng)物。
●總血紅蛋白可以分為A，A2，F(xiàn)三種組分，其中F主要在胎兒期，而成人主要為A，是由兩個(gè)a鏈和兩個(gè)β鏈構(gòu)成。A2由兩個(gè)a鏈和兩個(gè)δ鏈形成，F(xiàn)由兩個(gè)a鏈和兩個(gè)y鏈形成。
●成人HbA占97%， 又可分為HbA0和HbA1兩種，HbA0為沒(méi)有被糖基化部分，而HbA1為被糖基化部分。
●正常人維持一定的血糖水平，即會(huì)形成正常范圍內(nèi)的HbA1,其中HbA1c為主要組分，HbA1a和HbA1b的 含量則非常低。所以在反映血糖水平時(shí)主要用HbA1c來(lái)表示。
●正常人平均HbA1c水 平約為5%?？侶bA1約占6%左右，而HbA1a和HbA1b總和尚低于1%。
糖化血紅蛋白HPLC檢測(cè)方法-金標(biāo)準(zhǔn)
● 目前HPLC法測(cè)定HbA1c使其準(zhǔn)確性和重復(fù)性得到很大的提高。
●美國(guó)臨床化學(xué)協(xié)(AACC)糖化血紅蛋白標(biāo)準(zhǔn)化分會(huì)和IFCCHbA1C標(biāo)準(zhǔn)化工作組建議，以DCCT研究中所"的方法”-HPLC方法作為檢測(cè)糖化血紅蛋白的金標(biāo)準(zhǔn)，希望以此使大多數(shù)的實(shí)驗(yàn)方法能夠參照“的方法”實(shí)現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)化。
●1993年美國(guó)1型糖尿病控制及并發(fā)癥實(shí)驗(yàn)( DCCT)和英國(guó)大規(guī)模的2型糖尿病控制與并發(fā)癥關(guān)系研究(UKPDS)的研究中把HbA1c作為糖尿病控制的一-個(gè)觀察指標(biāo)。
●1996年4月起在日本，HbA1c被納入老年人保健法中糖尿病篩選的檢查項(xiàng)目。
●2002年美國(guó)糖尿病協(xié)會(huì)(ADA)已將其作為監(jiān)測(cè)糖尿病控制的金標(biāo)準(zhǔn)對(duì)其應(yīng)用也作了明確的規(guī)定:即所有糖尿病患者均應(yīng)常規(guī)測(cè)定HbA1c。其初診時(shí)測(cè)定結(jié)果為基線時(shí)的代謝狀況，此后的測(cè)定值則作為糖尿病*治療控制中的一部分， 這樣在提高糖尿病診斷水平、血糖控制、慢性并發(fā)癥的防治中具有十分重要的應(yīng)用價(jià)值
填料描述
Target-Gly填料基質(zhì)為聚苯乙烯-二乙烯苯(PS/DVB)球形顆粒。運(yùn)用特殊的化學(xué)鍵合技術(shù)， 將離子交換功能基團(tuán) 均勻細(xì)密地鍵合在聚合物親水層的表面。
填料穩(wěn)定性
由于 PS/DVB 的表面修飾是*基于化學(xué)鍵鍵合，所以Target-Gly離子交換填料具有優(yōu)異的穩(wěn)定性。 該固定相能夠 與大多數(shù)緩沖液如醋酸銨、磷酸鹽、Tris 等相容。在 pH 6.0時(shí)以 20mM磷酸鹽緩沖溶液為流動(dòng)相運(yùn)行Target-Gly色譜柱，柱效幾乎沒(méi)有變化。
流動(dòng)相兼容性
與水溶液，水與乙腈、丙酮或甲醇的混合物等相容。典型的緩沖液包括磷酸鹽、Tris和醋酸鹽等。
流速
內(nèi)徑為3.0-4.6mm的色譜柱典型操作流速為0.40-1.0mL/min。
安全注意事項(xiàng)
離子交換柱通常在高壓下運(yùn)行。如果管路連接不緊，將會(huì)導(dǎo)致有機(jī)溶劑和注入樣品的泄漏，從而對(duì)操作人員的健康產(chǎn)生影響。一旦發(fā)生泄漏，應(yīng)佩戴適當(dāng)?shù)氖痔走M(jìn)行處理。另外當(dāng)打開(kāi)色譜柱時(shí)還應(yīng)采取適當(dāng)?shù)谋Ｗo(hù)措施，以防止微小的高分子顆粒進(jìn)入呼吸道。
色譜柱安裝與操作
色譜柱在運(yùn)輸過(guò)程中或在沒(méi)有使用時(shí)，它的兩端總是用堵頭進(jìn)行密封。當(dāng)將色譜柱接入色譜儀器系統(tǒng)時(shí)，首先移去兩端的堵頭。請(qǐng)注意將流動(dòng)相流動(dòng)的方向與柱上標(biāo)記的方向保持一致。除非出于特殊考慮，例如為了清除堵在色譜柱入口端的臟污等而需要將色譜柱反接以進(jìn)行沖洗時(shí)，建議用戶在接上色譜柱時(shí)一定要遵循柱上標(biāo)記的方向。由于色譜柱的連接是整個(gè)色譜操作過(guò)程的一部分，如果密封卡套過(guò)緊或安裝不合適，或者密封卡套與色譜柱端口不匹配，都有可能導(dǎo)致溶液的泄漏。請(qǐng)按照下面步驟將色譜柱與密封卡套相連接，從而將色譜柱接入 HPLC 系統(tǒng)：
（1）di一次使用的管線，請(qǐng)依次將管線接頭和密封卡套裝在外徑 1/16”的管線上。密封卡套的寬口端應(yīng)朝向管線接頭。
（2）將管線緊緊插入色譜柱的接口，向前滑動(dòng)密封卡套和管線接頭，并使管線接頭的螺紋與色譜柱端口的螺紋相互銜接，然后擰緊管線接頭。如果管線為高分子材料，請(qǐng)轉(zhuǎn)到步驟（4）；如果是金屬管線，請(qǐng)繼續(xù)（3）。
（3）在用力將管線壓入柱端接口之后，用 1/4”扳手將已擰緊的螺帽再進(jìn)一步緊固。
（4）對(duì)色譜柱的另一端采用上述方法進(jìn)行操作。
樣品與流動(dòng)相
為了避免色譜柱的堵塞，所有樣品和溶劑，包括緩沖溶液在內(nèi)，都必須在使用前用 0.45m 或 0.2m 的濾膜 過(guò)濾。 建議使用預(yù)柱濾片（0.5m孔徑）或保護(hù)柱來(lái)保護(hù)色譜柱。Target-Gly 色譜柱可以使用水溶液， 或者有機(jī) 溶劑 （如甲醇、乙腈）與水的混合物等來(lái)作為流動(dòng)相。典型的流動(dòng)相中含有磷酸、醋酸或 Tris 的鈉鹽或鉀鹽。 流動(dòng)相在使用 前需要脫氣。一個(gè)簡(jiǎn)單的脫氣方法是將流動(dòng)相在由水泵形成的真空下超聲 5min。
色譜柱的使用
1）新的Target-Gly 色譜柱的運(yùn)輸溶劑是 20mM 磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）。在儲(chǔ)存和運(yùn)輸過(guò)程中， 填料可能會(huì)干涸。 第_一 次使用時(shí)，建議用 10-20 倍柱體積的運(yùn)輸溶劑進(jìn)行沖洗以活化色譜柱。 接著可用用戶自己選擇的流動(dòng)相沖洗色譜柱 進(jìn)行平衡。 流速由0.1mL/min 逐漸升至所需的操作條件，直至基線穩(wěn)定為止。 如果柱壓和基線波動(dòng)較大，這可能是 氣泡進(jìn)入了色譜柱中。這時(shí)可用較高流速?zèng)_洗色譜柱 3-10 分鐘，例如 4.0*33mm的色譜柱可采用流速 1.5-2.0mL/min。 如果 流動(dòng)相的類型或 pH與色譜柱中的儲(chǔ)存溶劑差異較大，建議將色譜柱先用新的流動(dòng)相沖洗 10 倍柱體積。
2）為了獲得*的分離 效果和延長(zhǎng)柱的使用壽命， 請(qǐng)盡量使用 pH 在 2-10 范圍內(nèi)的流動(dòng)相。
3）正常的操作壓力應(yīng)當(dāng)?shù)陀?,500psi
4）zui高操作溫度為 80℃。為了延長(zhǎng)柱的使用壽命，請(qǐng)盡量在60℃范圍內(nèi)操作。
5）*不用時(shí)，Target-Gly色譜柱應(yīng)保存在含 0.1%NaN3 的 20mM 磷酸鹽緩沖液（pH 6.0）中。色譜柱需要用 儲(chǔ)存緩 沖溶液沖洗至少20倍柱體積。然后再用隨色譜柱附上的兩個(gè)可拆卸的堵頭塞緊色譜柱的兩端以防止柱床的干涸。
色譜柱的清洗
在使用過(guò)程中，樣品經(jīng)常會(huì)被吸附在柱入口端的篩板或者填料上。當(dāng)樣品吸附累積到一定程度時(shí)，柱壓將會(huì)升高，色譜峰形也會(huì)出現(xiàn)展寬。這時(shí)就需要清洗色譜柱了。下面是色譜柱清洗的基本步驟：
1）將色譜柱與檢測(cè)器斷開(kāi)；
2）將色譜柱反接后進(jìn)行沖洗；
3）將流速設(shè)置到所*的zui大流速的 50%進(jìn)行沖洗。注意柱壓的變化。如果柱壓超出正常水平許多， 則需要降低 流速， 或選用低粘度的清洗溶液；
4）通常 10-15 倍柱體積的清洗溶液就足夠了。低 pH 的鹽溶液有助于去除堿性蛋白。 高 pH 的鹽溶液有助于去除酸性 蛋白。 有機(jī)溶劑可去除疏水蛋白。Target-Gly色譜柱清洗溶液為含 1.0M NaCl pH10的50mM 磷酸鹽緩沖液.
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